一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种表达高活性冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)的基因工程菌的构建方法，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β‑酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)同时敲除，并转入硫酯酶基因(Fat)表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。本发明专利技术还提供了上述方法构建得到的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。本发明专利技术的构建方法简单易操作，且得到的基因工程菌能够表达高活性的冰核蛋白。

A Genetically Engineered Strain Expressing Highly Active Ice Nucleoprotein and Its Construction Method

【技术实现步骤摘要】
一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法。
技术介绍
自然界中的水在0℃不会结冰，而是处于一种超临界状态，直至-15℃～-2℃才可结冰；纯水则需要在-40℃才可结冰。冰核蛋白(icenucleationprotein,INP)是一类可以使水在较高温度下(-5℃～-2℃)形成冰晶的特殊蛋白质，对于冰核蛋白的利用，多是以冰核细菌为载体，冰核细菌主要包括草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)和菠萝泛菌(Pantoeaananas)等，其在人工降雨降雪、食物冷冻保鲜及高敏检测等方面具有远大的应用前景，如：在杀虫方面，提高农业害虫的越冬死亡率是有效控制虫害的可行方法，构建促冻杀虫的基因工程菌，并使其在害虫肠道内有效定殖，可提高害虫的过冷却点，实现低温冻杀的效果，为越冬妨害提供一条途径；在食品行业，常规的低温冷冻食品，在冻结过程中因形成较大的冰晶，造成细胞损伤，解冻时细胞内容物流失，不仅破坏食品的风味，更导致营养流失，冰核蛋白能够使食物在较高的温度下快速结冰，将冰河活性细菌用于食品冷藏，不但改善了冷冻食品的品质，也节省了能源和时间；在人工降雪与降雨方面，利用冰核细菌提高液体过冷却点的特性，可以用于人工降雪和人工降雨，不但可调节天气，还可应用于体育娱乐以及北极的冰川构建等方面。冰核蛋白的利用主要是通过调整温度、pH值等发酵条件促进冰核细菌中冰核蛋白的表达，或者通过提取纯化冰核蛋白来实现，但是草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)和菠萝泛菌(Pantoeaananas)等冰核细菌的遗传背景复杂，基因改造存在一定的难度，以此为工程菌对其进行改造限制了冰核活性的提高和冰核蛋白的最大性利用。纯化冰核蛋白虽然可以确保其安全性，但研究表明冰核蛋白需要和细胞膜的脂质结合才能最大程度的发挥作用，因此必须有载体菌才能实现冰核蛋白活性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以表达高活性冰核蛋白的基因工程菌及其构建方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)同时敲除，并转入硫酯酶基因(Fat)表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。进一步，所述大肠杆菌为E.coliMG1655、E.coliDH5α或E.coliBW25113中的任一种。进一步，所述大肠杆菌为E.coliMG1655。进一步，所述β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步，所述硫酯酶基因为拟南芥硫酯酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步，冰核蛋白基因为来自菠萝泛菌的冰核蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步，通过P1噬菌体转导或Red重组技术敲除β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)。进一步，所述硫酯酶表达载体的构建方法为将硫酯酶基因与质粒pBAD43连接。进一步，所述冰核蛋白基因表达载体的构建方法为将冰核蛋白基因与载体pQE30连接。本专利技术还提供了上述方法构建得到的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。本专利技术的有益效果是：专利技术人意外的发现载体菌的脂肪酸链长较短、饱和程度较高有利于冰核蛋白活性的提高，在构建冰核蛋白工程菌的过程中，将工程菌的fadR和fabF基因敲除，并表达硫酯酶基因，可以提高冰核蛋白工程菌的冰核蛋白活性，并且以大肠杆菌作为初发菌株，其遗传背景清晰，工程菌的构建方法简单、可操作性强、效率高。灭活的大肠杆菌安全性强、可用范围较广。附图说明图1为本专利技术实施例2中MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体的PCR凝胶电泳图，其中M为marker，泳道1-3为用fadR的引物对(FadR-F+FadR-R)进行扩增的产物，泳道4-6为用fabF的引物对(FabF-F+FabF-R)进行扩增的产物，泳道1和4为对照MG1655野生型菌株的PCR结果，泳道2和5为双基因敲除后在柠檬酸钠和卡那抗性板上筛选得到的未进行卡那抗性切除的阳性克隆的PCR结果，泳道3和6为切除卡那抗性后的阳性克隆的PCR结果；图2为本专利技术实施例2中MG1655-△fadR-△fabF双敲除突变体的脂肪酸组分分析结果图；图3为本专利技术实施例5中不同的工程菌冰核蛋白活性检测结果。具体实施方式以下结合附图及具体实施例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。冰核细菌一般包括草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、菠萝泛菌(Pantoeaananas)等，但是这些野生菌遗传背景复杂，不利于基因改造。专利技术人在利用大肠杆菌构建冰核蛋白工程菌的过程中发现，以大肠杆菌为出发菌株，对其中的β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因(FabF)和脂肪酸降解抑制因子基因(FadR)进行敲除，并转入硫酯酶基因(Fat)表达载体和冰核蛋白基因表达载体，可以得到表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。以下实施例中涉及的菌株和质粒来源如下：E.coliMG1655、E.coliDH5α和E.coliBW25113均购自中科院微生物所菌种保藏中心；BW25113-△fadR和BW25113-△fabF购自BW25113keio单基因突变体文库。实施例1出发菌株的选择与优化大肠杆菌虽然为条件致病菌，但其灭活菌株不具致病性，且灭活菌株亦可保证冰核蛋白活性，并且大肠杆菌遗传背景清晰，基因改造的安全性高、可操作性强，且高效，因此选择将大肠杆菌作为冰核蛋白工程菌的出发菌株。野生型大肠杆菌MG1655、DH5α和BW25113均可作为出发菌株。专利技术人研究发现，冰核蛋白菌株的冰核蛋白活性与菌株的脂肪酸饱和程度以及平均链长有关，菌株自身的脂肪酸饱和程度越高，平均链长越短，冰核蛋白的活性越高，因此，在其中一个最优选方案中，比较三株野生型大肠杆菌MG1655、DH5α、BW25113的链长以及饱和程度，选择脂肪酸链长较短、且饱和程度较高的菌株作为遗传改造的出发菌株。脂肪酸含量和种类的检测方法如下：1、脂肪酸的提取和甲酯化：取野生型大肠杆菌E.coliMG1655、E.coliDH5α和E.coliBW25113各1mL，加入2.4mL2％乙酸溶液(溶于甲醇)，1mL氯仿，加入0.2mgC20:0甲酯作为内标，涡旋；加入1.5mL氯仿，1.2mL水，涡旋，4000rpm离心10min，分层；取出下层溶液至新管①中，加入1mL氯仿至原管中，涡旋，4000rpm离心10min，取出下层溶液合并至管①中，混匀，真空干燥，即可得到所有的脂类；按每5mL(色谱级)中加入2滴乙酰氯的比例配制形成HCL-CH3OH溶液，向每个管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β‑酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因和脂肪酸降解抑制因子基因同时敲除，并转入硫酯酶基因表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，将大肠杆菌的β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因和脂肪酸降解抑制因子基因同时敲除，并转入硫酯酶基因表达载体和冰核蛋白基因表达载体，得到所述表达高活性冰核蛋白的基因工程菌。2.根据权利要求1所述的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliMG1655、E.coliDH5α或E.coliBW25113中的任一种。3.根据权利要求2所述的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coliMG1655。4.根据权利要求3所述的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述脂肪酸降解抑制因子基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.根据权利要求4所述的表达高活性冰核蛋白的基因工程菌的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：于非非，朱坤，吴金贤，曲炳良，余祥勇，刘永，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东,44