大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR及应用制造技术

本发明专利技术公开了大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR及应用，大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示。大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR所编码的蛋白质的氨基酸序列用SEQ ID No.2所示。本发明专利技术所构建的包含大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)的工程菌生物安全，遗传背景清晰，包含的大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)在细菌耐药性遗传机制研究方面具有重要应用。

Mutant gene soxR of global regulatory factor in Escherichia coli and its application

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR及应用
本专利技术属于大肠杆菌遗传工程及抗生素耐药性的研究领域。具体而言，涉及一种大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)及该基因编码的氨基酸序列及应用。
技术介绍
抗生素是能选择性地抑制某些生物生命活动的微生物次级代谢产物，及其半合成或全合成的衍生物；广泛应用于医疗行业以及畜牧、渔业等农业部门，为人类社会发展做出了重要贡献。然而，抗生素的过度使用以及环境中存在的抗生素所造成的选择压力加剧了细菌耐药性的形成以及多重药物耐药性菌株的出现，给医疗行业带来了前所未有的挑战。另外，日益严峻的抗生素环境污染问题也越来越多的引起了人们的重视。微生物能够感应外界环境的变化，通过调控因子调控相关基因的表达来调节细胞的一系列生理活动。SoxR属于MerR蛋白家族(汞抗性操纵子调节因子家族)，通过调控soxS的表达来调节下游一系列基因的表达。已有研究表明SoxR的突变对于微生物的抗生素耐药性有重要影响，Koutsolioutsou等研究发现SoxR蛋白第128位丝氨酸残基删除、第20位精氨酸突变为组氨酸菌株表现出抗生素耐药表型(Koutsolioutsou,Pena-Llopis，&Demple.2005)。Tugce等的研究也发现，在高浓度的选择压力下soxR基因编码蛋白发生的氨基酸突变A146V及G143D会导致大肠杆菌对氯霉素产生耐药性(Oz,Guvenek,Yildiz,Karaboga,Tamer,&Mumcuyan,etal.2014)。鉴于全局调控因子在微生物生理代谢活动中所产生的多方面影响及其在抗生素耐药性方面的重要作用，本专利技术公开了采用全局调控因子工程所鉴定的细菌抗生素耐药性相关基因以及构建的抗生素高耐药性菌株，为细菌耐药性机制研究提供重要的应用支持。目前，研究大都以肠球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等多药耐药性菌株作为模式生物来研究抗生素多药耐药性，尚未有大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)在抗生素多药耐药性研究领域的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR。本专利技术的第二个目的是提供一种大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR所编码的蛋白质。本专利技术的第三个目的是提供包含有大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR的工程菌。本专利技术的第四个目的是提供所述工程菌在细菌耐药性遗传机制研究的应用。本专利技术的技术方案概述如下：大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)，所述突变基因的核苷酸序列是SEQIDNo.1所示；大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)所编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列是SEQIDNo.2所示；包含有所述大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)的工程菌。上述工程菌在细菌耐受性遗传机制研究的应用。本专利技术所构建的包含大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)的工程菌生物安全，遗传背景清晰，包含的大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR(G121P)在细菌耐药性遗传机制研究方面具有重要应用。附图说明图1为包含大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR的工程菌(简称工程菌株E.coliMG6)对多西环素耐药性验证。图2为工程菌株E.coliMG6对甲砜霉素耐药性验证。图3为工程菌株E.coliMG6对阿奇霉素耐药性验证。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，但对本专利技术不作任何限制。本专利技术所用到的原始菌株E.coliMG1655来源为ATCC保藏的典型菌株(700926)。本专利技术所用到的甲砜霉素从上海源叶生物科技有限公司(http://www.shyuanye.com)购买，所用限制性内切酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。实施例1全局调控因子突变文库的设计和高通量合成基于CRISPR可追踪基因工程(CRISPRenabledtrackablegenomeengineering,CREATE)系统，包括三个质粒：阿拉伯糖诱导Cas9蛋白表达的质粒X2-cas9、热激诱导表达λ-red重组系统的温度敏感型质粒pSIM5、gRNA和供体DNA表达的全局调控因子突变文库质粒(Garst,Bassalo,Pines,Lynch,Halweg-Edwards,&Liu,etal)。全局调控因子突变文库质粒盒子序列总共200bp，包括17bp子文库引物序列、100bp同源臂、4bp间隔序列、35bpgRNA启动子序列、gRNA序列与Cas9蛋白结合的序列。通过将混合的文库质粒转化进入大肠杆菌，实现一次转化下的多个细胞的突变。本专利技术中所用到的全局调控因子突变文库包含大肠杆菌23个全局调控因子涉及的34340个突变，是根据调控因子数据库RugulonDB和Ecocyc的分析选择了23个全局调控因子，然后从数据库RugulonDB，NCBI和Ecocyc中提取最可能对靶位点(即DNA结合位点，活性位点，二聚化位点和预测位点)的调节因子具有功能性影响的位点作为调控因子饱和突变位点，利用全局调控因子突变文库自动化设计工具Bioverse(http://www.thebioverse.org/)设计突变文库，设计的文库序列经由美国安捷伦公司(AgilentTechnologies)合成。通过公司合成的全局调控因子突变文库片段，首先经过20轮PCR延伸反应，然后延伸产物利用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)胶分离和纯化。纯化后的产物作为模板，利用设计的引物进行子文库的扩增，扩增产物进一步经过纯化，最后利用Gibson组装方法连接到全局调控因子突变文库载体质粒，获得5个质粒形式的不同子文库，这五个文库分别命名为G1，G2，G3，G4和G5，每个文库的信息详见表1。表1文库的分类实施例2基于全局调控因子突变文库构建大肠杆菌突变体库(1)采用电转法将X2-cas9质粒导入到菌株E.coliMG1655操作流程如下：将-80℃冻存的野生型E.coliMG1655在LB固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有5mlLB液体培养基的试管中，在37℃、220rpm培养12h。以1％的接种量接种到装有100mlLB液体培养基的500ml三角瓶中，在37℃、220rpm培养大约2h，至OD600为0.35。将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用预冷的无菌水和10％甘油各洗两次，然后用1mL预冷的10％甘油重悬菌体，最后分装到预冷的1.5mL无菌EP管中，每管100μl，得到制备好的MG1655感受态。向MG1655感受态中加入3μlX2-cas9质粒，混匀后加入电击杯中，使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪在1.8KV条件下电击4.5ms，电击后迅速加入800μlLB液体培养基，然后在3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR，其特征是所述突变基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR，其特征是所述突变基因的核苷酸序列是SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述的大肠杆菌全局调控因子的突变基因soxR所编码的蛋白质，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王智文，陈聪，张双虹，王倩，李书廷，陈涛，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12