一种提高植物类黄酮含量的基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高植物类黄酮含量的基因及应用。该基因TeTF5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术在万寿菊成熟花中克隆获得了TeTF5基因。基因表达水平分析结果表明，TeTF5在芦丁含量较高的万寿菊成熟花中表达量较未成熟花显著升高。当在烟草叶片中表达TeTF5基因时，黄酮类化合物含量增加。本发明专利技术从万寿菊所克隆TeTF5基因在类黄酮生物合成中发挥调控作用，能够用于提高植物中芦丁等黄酮类化合物含量。

A Gene for Improving Flavonoid Content in Plants and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种提高植物类黄酮含量的基因及应用
本专利技术涉及植物遗传工程
，具体涉及一种从万寿菊中克隆获得的类黄酮合成途径调控基因TeTF5，以及该基因在调控植物中芦丁等黄酮类化合物含量方面的应用。
技术介绍
类黄酮(flavonoids)是一类具有黄烷核基本骨架(两个具酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接)的多酚类重要次生代谢物。在植物中，类黄酮在病原菌防御、紫外辐射等多种生物、非生物胁迫中发挥重要保护作用。由于黄酮类化合物能够清除自由基、抗辐射，同时也能降低毛细血管的通透性和脆性，具有多种药用功效，可以防治高血脂症、糖尿病及高血压等疾病。同时，一些黄酮类化合物，如芦丁(rutin)也可作为复配药和药物中间体，有广泛的药用价值。此外，类黄酮可以作为添加剂，以天然食用色素和抗氧剂进行使用。由于类黄酮吸收紫外线能力较强，也可以在化妆品中作为防晒霜的主要成分加以利用。类黄酮在植物中虽广泛存在，但目前提取芦丁等黄酮类化合物的植物原料主要为苦荞、槐米、橙皮、芦笋等。万寿菊(TageteserectaL.)属菊科一年生草本植物，虽原产于墨西哥及美洲地区，但在中国云南、山东、内蒙古等地都有规模种植。万寿菊花色鲜艳，呈黄色至橙红色，花期较长，使其成为园林观赏植物。此外，由于万寿菊花中富含类胡萝卜素，通过培育种植高色素含量品种，使其成为提取类胡萝卜素，尤其是叶黄素的一种主要植物资源。除类胡萝卜素之外，万寿菊中还富含酚类、萜类物质，使其具备较高的食用和药用价值。通过对模式植物的研究，类黄酮的合成途径主要步骤已有较清楚的了解。前体物质丙二酰辅酶A、香豆酰辅酶A在查尔酮合成酶(chalconesynthase，CHS)和查尔酮异构酶(chalconeisomerase，CHI)作用下形成柚皮素，然后由黄烷醇3-脱氢酶(flavanone3-hydroxylase，F3H)、黄烷醇合成酶(flavonolsynthetase，FLS)等酶催化下形成各种下游黄酮类化合物质。其中CHS是黄酮类生物合成的第一个关键酶，也是整个合成过程中的重要限速酶，直接影响着下游黄酮类化合物的生物合成。万寿菊中富含多酚类物质，提示其类黄酮合成途径也可能较为活跃，但对万寿菊合成途径相关催化酶基因、调控基因序列信息所知甚少。编码类黄酮合成途径各反应步骤催化酶的基因是万寿菊中黄酮类物质合成的分子基础，而调控这些催化酶表达的转录基因则可能发挥重要的整体调节作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种调控万寿菊类黄酮合成途径的基因TeTF5。本专利技术要解决的另外一个技术问题是提供上述TeTF5基因在调控植物类黄酮合成中的应用。对于TeTF5基因，本专利技术提供的技术方案是，一种调控万寿菊类黄酮合成途径的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还包括上述TeTF5基因在调控植物类黄酮合成中的应用。本专利技术从万寿菊中克隆类黄酮生物合成调控基因，命名为TageteserectaTranscriptionFactor5(简称TeTF5)。本专利技术从万寿菊中进行TeTF5基因的克隆：根据对万寿菊的高通量转录组深度测序对TeTF5基因进行数据组装；然后利用引物设计软件PrimerPremier5.0设计2对巢式PCR特异引物，从万寿菊成熟花花瓣中提取总RNA，反转录PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)克隆获得TeTF5基因。通过在万寿菊未成熟、成熟花组织的基因表达水平分析和黄酮类代表物质芦丁含量测定，以及表达TeTF5基因的烟草叶片中总黄酮、芦丁含量的检测，表明TeTF5基因在类黄酮合成中发挥作用，能够用于调控植物中黄酮类化合物的含量。本专利技术的有益效果是：本专利技术的万寿菊基因TeTF5为在植物中类黄酮的合成提供了一种新的调控基因资源，可用于富含类黄酮植物材料的培育和改良。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例的万寿菊未成熟花、成熟花中TeTF5、TeCHS基因表达量分析，及对应样品中黄酮类代表物质芦丁的含量测定结果。图2是本专利技术实施例TeTF5基因在烟草叶片中表达的Westernblot蛋白印迹检测结果。具体实施方式下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如SambrookJ.和Russell，D.W.的分子克隆实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：万寿菊高通量转录组测序由于万寿菊基因组尚未测定，为获得万寿菊功能基因转录本序列，利用万寿菊栽培品种组织样品，通过分别提取三个单株的叶片、未成熟花、成熟花RNA各1份，进行高通量转录组序列测定与组装注释。1、试剂植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(DnaseI)购于TaKaRa公司，RNA文库制备试剂盒(RNALibraryPrepKit)来自北京百迈客生物科技有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。2、植物材料万寿菊(TageteserectaL.)栽培品种菊王购于赤峰鑫卉园艺公司。3、方法3.1RNA提取1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入1mlTrizol，剧烈震荡，室温放置5min；2)离心管中加入200μL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min；3)4℃，12000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；4)将上清液700μL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min；6)4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉于管底；7)加入1mL70％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；9)室温干燥5-10min；10)加入50μL无RNA酶水(RNase-freeH2O)，溶解RNA；11)根据RNA溶液浓度取RNA50μg，加入5μL10X缓冲液(400mMTris-HCL，pH7.5，80mMMgCl2，50mMDTT)、5μLDnaseI、2μLRNA酶抑制剂，37℃反应30min；12)加入2.5μL0.5MEDTA，80℃，2min失活Dnase；13)加入10μL3M醋酸钠和250μL预冷的乙醇，-80℃放置20min；14)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；15)加入1mL70％乙醇清洗RNA；16)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；17)室温干燥5-10min；18)加入50μL无RNA酶水，溶解RNA；19)检测RNA样品的纯度、浓度。3.2转录组测序组装与注释转录组测序利用RNALibraryPrepKit，通过北京百迈客生物科技有限公司IlluminaHiSeq高通量测序平台，按以下步骤进行：1)用带有Oligo(dt)的磁珠富集真核生物RNA，将mRNA进行随机打断；2)以mRNA为模版，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入dNTPs、RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控万寿菊类黄酮合成的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控万寿菊类黄酮合成的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛向丽，王瑞鹏，冯国栋，商亚芳，黄胜雄，王莹莹，徐焕焕，王洋，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34