毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用制造技术

本发明专利技术提供了毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术研究发现，将毛果杨PtrMYB119基因转入烟草叶片，获得的转基因烟草中的花青素含量显著提升，可有效提高烟草的抗旱性。

Application of PtrMYB119 Gene of Populus tomentosa in Improving Drought Tolerance of Tobacco

【技术实现步骤摘要】
毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。
技术介绍
干旱会导致植物细胞含水量下降，活性氧自由基爆发，破坏植物细胞膜系统，导致植物生长发育迟缓，甚至死亡从而造成植物减产。目前，世界上有三分之一以上的土地属于干旱和半干旱地区，干旱一直是影响农业发展的主要原因之一，如今干旱灾害范围、程度和频次均呈增加趋势，使农作物的生长发育受到严重阻碍，作物产量降低造成巨大的经济损失。提高植物的抗旱能力已经成为现代植物研究工作中的关键问题之一，抗旱机理的研究是抗旱育种的基础，也是育种的关键因素之一。因此，挖掘具有抗旱作用的基因对于培育抗旱性植物具有重要的意义。花青素是一种具有天然生物活性的植物色素，其在营养器官中的合成和积累对植物适应和抵抗恶劣的环境条件至关重要，可以增强植物对不同生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力，比如，干旱、高温、低温盐胁迫、病虫害等。花青素在植物组织中的呈色机理、花青素的生物合成调控方面的研究较多，而其在植物抗性方面的研究较少，越来越多研究表明花青素在植物应对非生物胁迫和生物胁迫中发挥着重要作用。
技术实现思路
有鉴于
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。优选的，所述应用包括如下步骤：(1)提取毛果杨总RNA，反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板，PCR扩增得到PtrMYB119基因；(2)将所述PtrMYB119基因插入原始载体中，得到重组植物表达载体；(3)将所述重组植物表达载体转化到根瘤农杆菌中，得到重组根瘤农杆菌转化子；(4)将所述重组根瘤农杆菌转化子侵染烟草叶片，得到T0代转基因植物。优选的，步骤(1)所述PCR扩增用引物对为PtrMYB119-F和PtrMYB119-R；所述PtrMYB119-F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述PtrMYB119-R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。优选的，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系为20μL：cDNA模板1μL、上下游引物各0.4μL(10μM)、10×Buffer2μL、dNTPs1.6μL、rTaq酶0.1μL，ddH2O14.5μL。优选的，步骤(1)所述PCR扩增的程序为：94℃，3min；30个循环，每个循环94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min；72℃终延伸10min。优选的，步骤(2)所述原始载体为pCAMBIA2300、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301或pCAMBIA3300。优选的，步骤(3)所述转化和/或步骤(4)所述转染后，还包括阳性鉴定的步骤。优选的，步骤(4)得到T0代转基因植物后，还包括将所述T0代转基因植物移栽到温室的步骤。进一步的，本专利技术还提供了含毛果杨PtrMYB119基因的重组植物表达载体在提高烟草耐旱性中的应用。进一步的，本专利技术还提供了含毛果杨PtrMYB119基因的重组根瘤农杆菌转化子在提高烟草耐旱性中的应用。有益效果：本专利技术提供了毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。本专利技术研究发现，将毛果杨PtrMYB119基因转入烟草叶片，获得的转基因烟草中的花青素含量显著提升，可有效提高烟草的抗旱性。附图说明：图1为本专利技术实施例1所述转基因植株鉴定结果，其中，图1-A为染色鉴定结果；图1-B为PCR鉴定结果。图2为转基因烟草干旱处理下的表型变化，其中，图2-A为干旱处理0天时的表型；图2-B为干旱处理10天时的表型；图2-C为干旱处理30天时的表型；图2-D为干旱处理30天时的根长统计结果；图2-E为干旱处理30天时的根长表型；图2-F为干旱处理30天时茎的表型；图2-G为干旱处理30天时茎横截面的表型。图3为转基因烟草干旱处理下花青素和叶绿素含量的变化，其中，图3-A为花青素含量的变化；图3-B为叶绿素含量的变化。图4为转基因烟草干旱处理下ABA含量和MDA含量的变化，其中，图4-A为ABA含量的变化；图4-B为MDA含量的变化。图5为转基因烟草干旱处理下POD、SOD和CAT活性的变化，其中，图5-A为POD活性的变化；图5-A为SOD活性的变化；图5-C为CAT活性的变化。图6为转基因烟草干旱处理下抗氧化基因、多胺生物合成基因和干旱响应基因的相对表达量，其中，图6-A为抗氧化基因的相对表达量；图6-B为多胺生物合成基因的相对表达量；图6-C为干旱响应基因的相对表达量。具体实施方式本专利技术提供了毛果杨PtrMYB119基因(序列号为：Potri.017G125600)在提高烟草耐旱性中的应用。本专利技术研究发现，将毛果杨PtrMYB119基因转入烟草叶片，获得的转基因烟草中的花青素含量显著提升，可有效提高烟草的抗旱性。在本专利技术中，所述应用优选包括如下步骤：(1)提取毛果杨总RNA，反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板，PCR扩增得到PtrMYB119基因；(2)将所述PtrMYB119基因插入原始载体中，得到重组植物表达载体；(3)将所述重组植物表达载体转化到根瘤农杆菌中，得到重组根瘤农杆菌转化子；(4)将所述重组根瘤农杆菌转化子侵染烟草叶片，得到T0代转基因植物。本专利技术先提取毛果杨总RNA，反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板，PCR扩增得到PtrMYB119基因。在本专利技术中，所述PCR扩增用引物对优选为PtrMYB119-F和PtrMYB119-R；所述PtrMYB119-F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述PtrMYB119-R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术中，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系优选为20μL：cDNA模板1μL、上下游引物各0.4μL(10μM)、10×Buffer2μL、dNTPs1.6μL、rTaq酶0.1μL，ddH2O14.5μL。步骤(1)所述PCR扩增的程序优选为：94℃，3min；30个循环，每个循环94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min；72℃终延伸10min。得到所述PtrMYB119基因后，本专利技术将所述PtrMYB119基因插入原始载体中，得到重组植物表达载体。在本专利技术中，所述原始载体优选为pCAMBIA2300、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301或pCAMBIA3300；更优选为pCAMBIA2300。本专利技术将所述重组植物表达载体转化到根瘤农杆菌中，得到重组根瘤农杆菌转化子。在本专利技术中，所述根瘤农杆菌优选为根瘤农杆菌EHA105。本专利技术优选对所述重组根瘤农杆菌转化子进行阳性鉴定。在本专利技术中，所述阳性鉴定优选挑取白色单菌落(重组根瘤农杆菌转化子)，接种在含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，250rpm，28℃摇菌培养4小时，用引物PtrMYB119-F和PtrMYB119-R进行PCR检测阳性克隆。得到重组根瘤农杆菌转化子后，本专利技术将所述重组根瘤农杆菌转化子侵染烟草叶片，得到T0代转基因植物。在本专利技术中，所述侵染优选使用浸泡法：将切成小片的烟草叶片浸泡在含所述重组根瘤农杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。

【技术特征摘要】
1.毛果杨PtrMYB119基因在提高烟草耐旱性中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取毛果杨总RNA，反转录获得cDNA，以所述cDNA为模板，PCR扩增得到PtrMYB119基因；(2)将所述PtrMYB119基因插入原始载体中，得到重组植物表达载体；(3)将所述重组植物表达载体转化到根瘤农杆菌中，得到重组根瘤农杆菌转化子；(4)将所述重组根瘤农杆菌转化子侵染烟草叶片，得到T0代转基因植物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增用引物对为PtrMYB119-F和PtrMYB119-R；所述PtrMYB119-F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述PtrMYB119-R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系为20μL：cDNA模板1μL、10μM的上下游引物各0.4μL、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄维兵，王鸿雪，刘天宇，王忠，王涛，张凤娇，束晓春，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32