本发明专利技术提供赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀农害活性的组合物和方法。提供包含毒素多肽的编码序列的组合物。编码序列可用于DNA构建体或表达盒中，用于在植物和细菌中转化和表达。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供分离的毒素核酸分子。另外，包括多核苷酸相应的氨基酸序列，以及特异性结合那些氨基酸序列的抗体。特别地，本发明专利技术提供分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，以及其变体和片段。
AXMI669 and AXMI991 Toxin Genes and Their Use
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AXMI669和AXMI991毒素基因及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年11月23日提交的美国临时申请系列号62/425,669和2016年11月23日提交的美国临时申请系列号62/425,729的权益，其内容通过引用整体并入本文。参考电子提交的序列表序列表的官方副本作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web以电子方式提交，其文件名为“APA16-6008WOSEQLIST.txt”，创建于2017年10月3日，大小为30kb，并与说明书同时提交。该ASCII格式的文档中包含的序列表是说明书的一部分，并且通过引用整体并入本文。
本专利技术涉及分子生物学领域。本专利技术提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂和生产转基因抗虫植物中。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)是形成革兰氏阳性孢子的土壤细菌，特征在于其能够产生对某些目和种的昆虫特别有毒的结晶包涵体，但对植物和其他非靶标生物体无害。由于该原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或其杀虫蛋白的组合物可用作环境可接受的杀虫剂以控制农业农害或用于各种人或动物疾病的昆虫载体。来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)主要对鳞翅目(Lepidopteran)、半翅目(Hemipteran)、双翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)幼虫具有有效的杀虫活性。这些蛋白还显示出对膜翅目(Hymenoptera)，同翅目(Homoptera)、虱毛目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和壁虱目(Acari)害虫的活性，以及对其他无脊椎动物目，如线虫(Nemathelminthes)、扁虫(Plaiyhelminthes)和肉鞭虫(Sarcomastigorphora)的活性(Feitelson(1993)TheBacillusThuringiensisfamilytree.InAdvancedEngineeredPesticides,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.)。这些蛋白最初主要基于其杀虫活性被分类为CryI至CryV。主要类别是鳞翅目特异的(I)、鳞翅目和双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)和线虫特异的(V)和(VI)。这些蛋白进一步分为亚科；每个科中更高度相关的蛋白被指定了分类字母，如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。每个分类中甚至更密切相关的蛋白被命名为如Cry1C1、Cry1C2等。基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(Crickmore等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。在该分类中，为每种毒素指定唯一名称，其包括第一等级(阿拉伯数字)、第二等级(大写字母)、第三等级(小写字母)和第四等级(另一阿拉伯数字)。罗马数字被替换为第一等级中的阿拉伯数字。具有低于45％序列同一性的蛋白具有不同的第一等级，第二和第三等级的标准分别为78％和95％。晶体蛋白在被昆虫中肠摄入和溶解之前不会表现出杀虫活性。摄入的原毒素被昆虫消化道中的蛋白酶水解成活性毒性分子(HofteandWhiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242-255)。该毒素与靶幼虫中肠中的顶端刷状缘受体结合，插入顶膜形成离子通道或孔，导致幼虫死亡。δ-内毒素通常具有五个保守序列域和三个保守结构域(参见，例如，deMaagd等人(2001)TrendsGenetics17：193-199)。第一个保守的结构域由7个α螺旋组成，其参与膜插入和孔形成。结构域II由以Greek关键构型排列的三个β-片层组成，结构域III由“果冻卷”形式的两个反平行β-片层组成(deMaagd等人，2001，同上)。结构域II和III参与受体识别和结合，因此被认为是毒素特异性的决定因素。除了δ-内毒素外，还有其他几种已知的杀虫蛋白毒素。VIP1/VIP2毒素(参见，例如，美国专利5,770,696)是二元杀虫毒素，其通过据信涉及受体介导的胞吞作用及随后的细胞毒性的机制表现出对昆虫的强活性，类似于其他二元(“A/B”)毒素的作用模式。A/B毒素，如VIP、C2、CDT、CST或炭疽杆菌(B.Anthracis)水肿和致死毒素，最初通过特定的受体介导的单体形式“B”组分结合，与靶细胞相互作用。然后这些单体形成同源七聚体。然后“B”七聚体-受体复合物作为对接平台发挥作用，其随后结合并允许酶促“A”组分通过受体介导的胞吞作用转运到胞质中。一旦进入细胞的胞质，“A”组分通过例如G-肌动蛋白的ADP-核糖基化或增加细胞内的环AMP(cAMP)水平来抑制正常细胞功能。参见Barth等人(2004)MicrobiolMolBiolRev68:373--402。基于苏云金芽孢杆菌的杀虫剂的大量使用已经在小菜蛾，Plutellaxylostella的田间种群中产生抗性(Ferre和VanRie(2002)Annu.Rev.Entomol.47：501-533)。最常见的抗性机制是减少毒素与其特定中肠受体的结合。这也可能赋予对具有相同受体的其他毒素的交叉抗性(Ferre和VanRie(2002))。考虑到昆虫可导致的破坏性以及控制昆虫农害导致的产率改善，因此不断需要发现新形式的杀虫毒素。专利技术概述本专利技术提供了向细菌、植物、植物细胞、组织和种子赋予杀农害活性的组合物和方法。组合物包括编码杀农害(pesticidal)和杀昆虫(insectidal)多肽序列的核酸分子、包含这些核酸分子的载体和包含载体的宿主细胞。组合物还包括杀农害多肽序列和针对所述多肽的抗体。核苷酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，用于在生物体(包括微生物和植物)中转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经设计用于在生物体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包括含有本专利技术核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，本专利技术提供了编码杀农害蛋白的分离的、重组的和嵌合的核酸分子。另外，本专利技术涵盖相应于该杀农害蛋白的氨基酸序列。特别地，本专利技术提供了包含核苷酸序列的分离的、重组的或嵌合的核酸分子以及其生物活性变体和片段，其中所述核苷酸序列编码SEQIDNO：2或4中所示的氨基酸序列，或所述核苷酸序列示于SEQIDNO：1或3中。本专利技术还包括与本专利技术的核苷酸序列互补或与本专利技术的序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。本专利技术还提供载体、宿主细胞、植物和种子，其包含本专利技术的核苷酸序列、或编码本专利技术的氨基酸序列的核苷酸序列、或其生物活性变体和片段。本专利技术提供用于产生本专利技术的多肽、以及用于使用这些多肽控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目农害的方法。本专利技术还包括用于检测样品中本专利技术的核酸和多肽的方法和试剂盒。本专利技术的组合物和方法可用于产生具有增强的农害抗性或耐性的生物体。这些生物体和包含该生物体的组合物是农业目的所期望的。本专利技术的组合物还可用于产生具有杀农害活性的改变或改善的蛋白，或用于检测产品或生物体中杀农害蛋白或核酸的存在。专利技术详述本专利技术涉及用于调节生物体，特别是植物或植物细胞的农害抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组核酸分子，其包含编码具有杀农害活性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：a)SEQ ID NO：1或3中所示的核苷酸序列；b)编码包含SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；c)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.23 US 62/425,669;2016.11.23 US 62/425,7291.一种重组核酸分子，其包含编码具有杀农害活性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：a)SEQIDNO：1或3中所示的核苷酸序列；b)编码包含SEQIDNO：2或4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；c)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：2或4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是设计用于在植物中表达的合成序列。3.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列与能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达的启动子可操作地连接。4.一种载体，其包含权利要求1所述的重组核酸分子。5.根据权利要求4所述的载体，其还包含编码异源多肽的核酸分子。6.一种宿主细胞，其含有权利要求1所述的重组核酸。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。8.根据权利要求6所述的宿主细胞，其是植物细胞。9.一种转基因植物，其包含权利要求8所述的宿主细胞。10.根据权利要求9所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。11.一种转基因种子，其包含权利要求1所述的核酸分子。12.一种具有杀农害活性的重组多肽，其选自：a)包含SEQIDNO：2或4的氨基酸序列的多肽；和b)包含与SEQIDNO：2或4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。13.根据权利要求12所述的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。14.一种组合物，其包含权利要求12的多肽。15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物选自粉末、撒粉剂、丸剂、颗粒、喷雾、乳剂、胶体和溶液。16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物通过干燥、冻干、均质、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩细菌细胞培养物来制备。17.根据权利要求14所述的组合物，其包含约1％至约99％重量的所述多肽。18.一种控制鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目农害群的方法，所述方法包括使所述群与杀农害有效量的权利要求12的多肽接触。19.一种杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目农害...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·多洛加齐，D·莱赫蒂宁，E·A·罗杰斯维埃拉，J·贝克，
申请(专利权)人：巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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