cry2Ah-vp基因在抗黏虫中的应用制造技术

本发明专利技术涉及cry2Ah‑vp基因在抗黏虫中的应用。本申请人在Cry2Ah的第354位缬氨酸后面插入一个脯氨酸而从中得到Cry2Ah1‑vp突变体如SEQ ID No.1所示。密码子优化后获得cry2Ah‑vp基因，利用农杆菌介导法将cry2Ah‑vp基因转入玉米，获得了T0代转基因玉米。实验结果表明cry2Ah‑vp基因在转基因玉米不同组织中可以正常转录，六叶期Cry2Ah‑vp蛋白在玉米各个部位的表达量最高，叶片的表达量为2.20μg/g(鲜重)，抽雄期和灌浆期各部位也有较高表达。抗虫实验结果显示转基因玉米对黏虫有很好的杀虫活性，接虫3天后黏虫全部死亡；对玉米螟幼虫有明显的生长抑制作用。

Application of cry2Ah-vp gene in resistance to armyworm

The present invention relates to the application of cry2Ah_vp gene in resistance to armyworm. This applicant inserted a proline after the 354th valine of Cry2Ah to obtain Cry2Ah1_vp mutant as shown in SEQ ID No.1. Cry2Ah_vp gene was obtained by codon optimization. Cry2Ah_vp gene was transferred into maize by Agrobacterium tumefaciens-mediated method, and T0 transgenic maize was obtained. The results showed that cry2Ah_vp gene could be normally transcribed in different tissues of transgenic maize. The highest expression of Cry2Ah_vp protein was found in all parts of Maize at six-leaf stage. The expression of cry2Ah_vp protein in leaves was 2.20 ug/g (fresh weight), and it was also highly expressed in all parts of Maize at heading and filling stages. The results of insect resistance experiment showed that the transgenic maize had good insecticidal activity against the armyworm, and all the armyworm died after 3 days of insecticidal inoculation, and had obvious growth inhibition effect on the larvae of corn borer.

【技术实现步骤摘要】
cry2Ah-vp基因在抗黏虫中的应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及cry2Ah-vp基因在抗黏虫中的应用。
技术介绍
玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，但由于虫害的发生每年玉米减产大约7％，严重时可达20％。1996年转基因抗虫作物开始商业化种植，Bt作物的广泛种植有效的防治了害虫，减少了杀虫剂的使用，降低了生产成本，对环境、有益昆虫及人畜等均无不良影响[BatesSL,ZhaoJZ,RoushRT,SheltonAM.InsectresistancemanagementinGMcrops:past,presentandfuture.NatureBiotechnology,2005,23:57-62.EstruchJJ,CarozziNB,DesaiN,DuckNB,WarrenGW,KozielMG.Transgenicplants:anemergingapproachtopestcontrol.NatureBiotechnology,1997,15:137-141.]。目前国际上抗虫转基因玉米主要转化的基因包括Btcry1Ab基因，如Mon810和Bt11；cry1F基因，如TC1507；vip3A基因，如MIR162；cry1A.105(cry1F和cry1Ac杂合)和cry2Ab2基因的MON89034等；国内正在研制的抗虫玉米转化的基因主要有cry1Ab、cry1Ac、cry1Ab/cry2Aj和cry1Ah等[韩岚岚,宋福平,张杰,赵奎军.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对棉铃虫活性分析.东北农业大学学报,2008,39(8):21-24.YangF,KernsDL,HeadGP,LeonardBR,NiuY,HuangFN.Occurrence,distribution,andeardamageofHelicoverpazea(Lepidoptera:Noctuidae)inmixedplantingsofnon-BtandBtcorncontainingSmartStaxTMtraits.CropProtection,2014,55:127-132.]。黏虫(Mythimnaseparata)是一种常见的玉米害虫，属鳞翅目夜蛾科，在幼虫时期暴食玉米叶片，严重发生时，可短期内吃光叶片，造成玉米减产甚至绝收[江幸福,张蕾,程云霞,罗礼智.我国黏虫发生危害新特点及趋势分析.应用昆虫学报,2014,51(06):1444-1449.]。现有的Bt基因对玉米螟有良好的防治效果，但在黏虫防治上还需要有效的抗虫基因[杨素娟,黄闽忠,李艳秋,周子珊,江幸福,高继国,程云霞,张杰.对黏虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选及分析.植物保护,2016,42(03):30-35.]。cry2Ah基因是从土壤样本中混合收集免培养获得，Cry2Ah蛋白对玉米螟有体重抑制活性，对棉铃虫有生长抑制活性，同时对cry1Ac抗性棉铃虫也有很好的生长抑制活性[ShuCL,ZhangJT,ChenGuiH,LiangGM,HeKL,CrickmoreN,HuangDF,ZhangJ,SongFP.UseofapooledclonemethodtoisolateanovelBacillusthuringiensisCry2AtoxinwithactivityagainstOstriniafurnacalis.JournalofInvertebratePathology,2013,114:31-33.]。现有的研究表明，Cry2Ah蛋白对黏虫有体重抑制，但没有致死作用(刘臣陈琳等，四种Bt蛋白对六种重要鳞翅目害虫的杀虫活性评价，中国生物防治学报，2017，33(6)774-779)。将Cry2Ah的第354位缬氨酸后面插入一个脯氨酸而从中得到Cry2Ah1-vp突变体，其在突变位置上与Cry2Ab具有相同的碳骨架。将两个基因分别转入烟草植株后，进行了棉铃虫和cry1Ac抗性棉铃虫杀虫活性的试验，结果表明Cry2Ah-vp与Cry2Ah相比具有更高的杀虫活性[LiSY,WangZY,ZhouYY,LiCH,WangGP,WangH,ZhangJ,LiangGM,LangZH.Expressionofcry2Ah1andtwodomainIImutantsintransgenictobaccoconfershighresistancetosusceptibleandCry1Ac-resistantcottonbollworm.ScientificReports,2018,8(1):508.]。本申请人在专利申请“人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用”(申请号2017101451666)中对mcry2Ah-vp基因序列及其转烟草的应用进行了详细的说明。
技术实现思路
针对上述领域中的需求，本专利技术提供cry2Ah-vp基因在抗黏虫中的应用，通过对Btcry2Ah-vp基因进行密码子优化，转入玉米中，实验表明，cry2Ah-vp基因具有极好的抗黏虫效果。蛋白Cry2Ah-vp在抗黏虫中应用，所述蛋白Cry2Ah-vp的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。所述应用，是将含编码蛋白Cry2Ah-vp的基因的载体转入玉米中，使其具有抗黏虫的特性。所述编码蛋白Cry2Ah-vp的基因序列如SEQIDNo.2所示。所述载体为pC2HBvp，其骨架载体是pCAMBIA3300。所述载体pC2HBvp的结构如图2所示。本申请人通过前期优化的Cry2Ah-vp蛋白见SEQIDNo.1，即将Cry2Ah(SEQIDNo.3)的第354位缬氨酸后面插入一个脯氨酸而从中得到Cry2Ah1-vp突变体(见专利申请“人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用”(申请号2017101451666))，并期根据玉米基因的密码子偏好性同时考虑tRNA转运饥饿对Btcry2Ah-vp基因进行密码子优化(见SEQIDNo.2)，优化后的cry2Ah-vp基因构建植物表达载体pC2HBvp，利用农杆菌介导法转入玉米中，获得T0代转基因玉米。在本研究中通过草铵膦筛选、PCR鉴定及目的蛋白含量检测，筛选得到了转基因事件VP1-5，并对VP1-5转基因玉米进行拷贝数分析和抗虫性实验。Southernblot检测结果表明cry2Ah-vp基因是以单拷贝的形式插入玉米基因组中；qRT-PCR检测结果表明cry2Ah-vp基因在VP1-5转基因玉米不同组织中可以正常转录；酶联免疫吸附测定(ELISA)检测结果显示，六叶期Cry2Ah-vp蛋白在玉米各个部位的表达量最高，叶片的表达量为2.20μg/gFW(鲜重)，抽雄期和灌浆期各部位也有较高表达。抗虫实验结果显示VP1-5转基因玉米对黏虫有很好的杀虫活性，接虫3天后黏虫全部死亡；对玉米螟幼虫有明显的生长抑制作用。黏虫危害严重影响玉米质量和产量，目前在其防治上亟需新的抗虫材料，Cry2Ah-vp蛋白是改造后具有很高抗黏虫活性蛋白，能够在玉米各个部位表达，因此VP1-5转基因玉米将会是玉米抗虫育种和害虫防治良好的种质资源，在玉米抗虫育种上有很好的商业化前景。附图说明图1植物表达载体pC2HB构建示意图，图2植物表达载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白Cry2Ah‑vp在抗黏虫中应用，所述蛋白Cry2Ah‑vp的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.蛋白Cry2Ah-vp在抗黏虫中应用，所述蛋白Cry2Ah-vp的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述应用，是将含编码蛋白Cry2Ah-vp的基因的载体转入玉米中，使其具有抗黏虫的特性。3.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：郎志宏，李圣彦，张杰，汪海，李梦桃，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11