一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法技术

本发明专利技术涉及一种基于质谱的完整N‑糖肽相对定量方法，包括以下步骤：培养正常生理体系和患病体系的细胞，提取两种细胞体系的全部蛋白质组，富集两种细胞的完整N‑糖肽，使用同位素酯化反应对完整N‑糖肽C端进行标记，使用同位素二甲基标记技术对完整N‑糖肽N端进行标记，将两种标记后的完整N‑糖肽1:1混合，使用RPLC‑MS/MS进行检测，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析。与现有技术相比，本发明专利技术能够在完整N‑糖肽水平上对正常体系和患病体系进行分析，找出潜在的生物标志物，方法简明，鉴定准确。适用于基于质谱的完整N‑糖肽的定量分析。

A Complete Method for Relative Quantification of N-Glycopeptides Based on Mass Spectrometry

【技术实现步骤摘要】
一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法
本专利技术涉及一种基于N-端和C-端等重标记和串级质谱成对碎片离子峰强度的完整N-糖肽相对定量方法，主要涉及与生物质谱相关的系统生物学、糖蛋白质组学等

技术介绍
蛋白质是生物体内生命活动的重要承担者，蛋白质的翻译后修饰对于蛋白质参与生物体内的生命活动有着重要作用。蛋白质组学通过对正常生物体系与疾病生物体系内的蛋白质组进行大规模检测，比较分析两种体系内的差异，可以找到某些疾病的生物标志物。目前定量分析的主要方法是通过同位素标记或者同重标记的方式对两种生物体系内的多肽进行标记，同位素标记技术主要是通过一级质谱的信号进行定量，同重标记是通过二级质谱报告离子的相对强度进行定量，相比于同位素标记，受杂质信号干扰小，准确度更好(Nicholson,J.K.；Lindon,J.C.；Holmes,E.,'Metabonomics':understandingthemetabolicresponsesoflivingsystemstopathophysiologicalstimuliviamultivariatestatisticalanalysisofbiologicalNMRspectroscopicdata.Xenobiotica1999,29(11),1181-1189.；Nicholson,J.K.；Connelly,J.；Lindon,J.C.；Holmes,E.,Metabonomics:aplatformforstudyingdrugtoxicityandgenefunction.NatureReviewsDrugDiscovery2002,1(2),153-161.；Nicholson,J.K.；Wilson,I.D.,Understanding'global'systemsbiology:Metabonomicsandthecontinuumofmetabolism.NatureReviewsDrugDiscovery2003,2(8),668-676.)。2004年iTRAQ技术商业化并进入市场，iTRAQ技术可以对多组多肽样本进行同位素标记并定量(Boersema,P.J.；Raijmakers,R.；Lemeer,S.；Mohammed,S.；Heck,A.J.R.,Multiplexpeptidestableisotopedimethyllabelingforquantitativeproteomics.NatureProtocols2009,4(4),484-494.)。其主要原理是将同位素标签标记到样本分子的氨基酸上，在标记后，不同标签标记的各组样本分子量仍然相同，由于同位素不改变化学性质，多肽样本在色谱中仍然同时洗脱，进入质谱，同时在一级谱图上不会区分，在将前体离子进行解离时，碎片信号会在二级谱上显示相差1Da的报告离子，达到定量的效果。稳定同位素标记技术(SILAC)，主要原理是利用同位素标记的氨基酸来培养细胞，在细胞不断生长、分裂的过程中，细胞内的蛋白质会由同位素标记氨基酸合成，一般在经历5-6次细胞传代以后，细胞中的蛋白质将都会带有同位素标记(Cox,J.；Mann,M.,MaxQuantenableshighpeptideidentificationrates,individualizedp.p.b.-rangemassaccuraciesandproteome-wideproteinquantification.NatureBiotechnology2008,26(12),1367-1372.)。18O同位素标记技术，主要原理是利用蛋白质酶切过程需要水参与反应，通过将溶液中的水全部替换成18O同位素标记的水，在酶切结束后，18O会被标记到多肽的C端，从而达到同位素标记的目的(Chu,F.；Mahrus,S.；Craik,C.S.；Burlingame,A.L.,Isotope-codedandaffinity-taggedcross-linking(ICATXL):Anefficientstrategytoprobeproteininteractionsurfaces.JournaloftheAmericanChemicalSociety2006,128(32),10362-10363.)。传统的准等重同位素标记技术大多采用13C和D的组合实现准等重标记，但由于D和H在色谱中可能存在保留时间的差异，导致标记两种多肽不能完全同时洗脱进入质谱进行检测，这会带来一定的定量误差。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，包括以下步骤：培养正常生理体系和患病体系的细胞，提取两种细胞体系的全部蛋白质组，富集两种细胞的完整N-糖肽，使用同位素酯化反应对完整N-糖肽C端进行标记，使用同位素二甲基标记技术对完整N-糖肽N端进行标记，将两种标记后的完整N-糖肽1:1混合，使用RPLC-MS/MS进行检测，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析。本专利技术中，在完整N-糖肽的C端使用酯化反应进行同位素标记时，其中，正常生理体系完整N-糖肽的C端使用CH3CH2CH2OH试剂进行标记，患病体系的C端使用(CD3)2CHOH试剂进行标记。本专利技术中，在完整N-糖肽的N端通过控制反应体系的pH值实现只对N端的二甲基标记，对于正常体系完整N-糖肽使用DCDO试剂和NaBD3CN试剂进行同位素标记，对于患病体系完整N-糖肽使用HCHO和NaBH3CN进行标记。本专利技术中，1:1混合指：按照正常生理体系和患病体系标记后完整N-糖肽的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。本专利技术中，经过同位素酯化反应、同位素二甲基标记技术对完整N-糖肽进行标记后，两种体系的完整N-糖肽具有相同的分子量。本专利技术中，使用RPLC-MS/MS进行检测时，在液相色谱中两种体系的完整N-糖肽同时洗脱，两种体系的完整N-糖肽同时进入质谱进行检测，通过二级质谱的b/y离子进行相对定量。本专利技术中，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析是指：对采集到的质谱数据进行定性和定量搜索，找出患病体系相对于正常体系差异表达的完整N-糖肽，获得其结构信息。GPSeeker数据库的具体信息请见：KaijieXiao,ZhixinTian*.GPSeekerenablesquantitativestructuralN-glycoproteomicsforsite-andstructure-specificcharacterizationofdifferentiallyexpressedN-glycosylationinhepatocellularcarcinoma.JournalofProteomeResearch,2019,10.1021/acs.jproteome.9b00191.本专利技术中，使用Trypsin酶切细胞的蛋白质，zic-HILIC富集细胞的完整N-糖肽。本专利技术中，蛋白质提取后，还原、烷基化、天冬氨酸及谷氨酸酯化保护，再使用Trypsi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于质谱的完整N‑糖肽相对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：培养正常生理体系和患病体系的细胞，提取两种细胞体系的全部蛋白质组，富集两种细胞的完整N‑糖肽，使用同位素酯化反应对完整N‑糖肽C端进行标记，使用同位素二甲基标记技术对完整N‑糖肽N端进行标记，将两种标记后的完整N‑糖肽1:1混合，使用RPLC‑MS/MS进行检测，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析。

【技术特征摘要】
1.一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：培养正常生理体系和患病体系的细胞，提取两种细胞体系的全部蛋白质组，富集两种细胞的完整N-糖肽，使用同位素酯化反应对完整N-糖肽C端进行标记，使用同位素二甲基标记技术对完整N-糖肽N端进行标记，将两种标记后的完整N-糖肽1:1混合，使用RPLC-MS/MS进行检测，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析。2.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，在完整N-糖肽的C端使用酯化反应进行同位素标记时，其中，正常生理体系完整N-糖肽的C端使用CH3CH2CH2OH试剂进行标记，患病体系的C端使用(CD3)2CHOH试剂进行标记。3.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，在完整N-糖肽的N端通过控制反应体系的pH值实现只对N端的二甲基标记，对于正常体系完整N-糖肽使用DCDO试剂和NaBD3CN试剂进行同位素标记，对于患病体系完整N-糖肽使用HCHO和NaBH3CN进行标记。4.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，1:1混合指：按照正常生理体系和患病体系标记后完整N-糖肽的...

【专利技术属性】
技术研发人员：田志新，连浩志，王悦，肖开捷，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海,31