本发明专利技术涉及一种在基于GC‑MS联用技术的脑缺血再灌注代谢组学(脂质组学)研究的方法。属于医药学技术领域。本发明专利技术包括如下步骤：(1)血浆样品预处理；(2)GC‑MS联用技术对血浆样品进行检测；(3)对数据进行分析：进行代谢物鉴定并找出最终的差异代谢物，通过在线分析软件对差异代谢物进行通路分析。数据分析内容主要包括：(1)利用XCMS在线数据处理软件对得到的原始数据进行处理(2)单维统计与多维统计相结合探究组别之间代谢差异(3)筛选并鉴定出对差异贡献大的变量并对其进行分析(4)利用MetaboAnalyst在线软件对代谢通路进行分析。本发明专利技术的方法简单，且减小了样本处理过程带来的误差。
METHODS FOR METABOLOGICAL STUDIES OF CEREBRAL ISCHEMIA REPERFUSION BASED ON GC-MS
【技术实现步骤摘要】
基于GC-MS联用技术的脑缺血再灌注代谢组学研究的方法
本专利技术涉及一种在基于GC-MS联用技术的脑缺血再灌注代谢组学(脂质组学)研究的方法。属于医药学
技术介绍
代谢组学是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物发生变化的科学，反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化。代谢组学的应用也十分广泛，在药物研发与评价、系统毒理学、疾病诊断等方面有重要作用。脂质组学为系统研究脂质组的一门独立学科，作为大规模定性和定量研究脂类化合物并了解他们在不同生理、病理条件下的功能和变化的方法学，能准确地全面地提供生物样品在不同生理条件下的全脂信息谱图。质谱(MS)是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。其同时具备高特异性和高灵敏度，具有广泛的动态范围并能进行可重现的定量分析，目前已被用于代谢组学的研究中。通常在进行质谱分析之前要运用气相色谱火液相色谱来进行分离。气相色谱和质谱(GC/MS)是分析挥发性化学物质的有效组合。GC/MS要求分析物能够挥发，以便在毛细管中进行迁移。因此，分析物必须具有挥发性，或能够经过化学衍生具有挥发性。因为本研究方法的目标物为大鼠血浆中的游离脂肪酸，相对分子量较低，易于挥发，因此选用气相色谱进行分离并由质谱进行分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于GC-MS技术进行血清代谢组学研究的方法，对实验样本进行代谢组学数据分析，并且由于对步骤进行了合并，减小了样本处理过程带来的误差。本专利技术采用的技术方案是：采用GC-MS联用技术检测分析大鼠血浆样品。具体包括如下步骤：(1)血浆样品预处理；(2)GC-MS联用技术对血浆样品进行检测；(3)对数据进行分析：进行代谢物鉴定并找出最终的差异代谢物，通过在线分析软件对差异代谢物进行通路分析。步骤(1)中：取血浆样本，加入抗氧化剂BHT，混匀。加入内标正十三烷酸，混匀，5％H2SO4-CH3OH,进行衍生化反应。冷却后，加入正己烷与饱和氯化钠溶液，涡旋，离心，取上层正己烷。重复操作一次，合并两次上清液，于室温下N2吹干，用正己烷复溶后进行GC/MS分析。步骤(2)中：色谱条件：色谱柱：AgilentVF-WAXms毛细管色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：初始温度100℃，以30℃/min升至180℃，再以2℃/min升至198℃，以1℃/min升至205℃，以2℃/min升至230℃，以,10℃/min升温至245℃,再以10℃/min降回230℃保持3min。载气：氦气，恒流模式，1.0mL/min，进样量：1μL，分流比为10：1。质谱条件：进样口温度：250℃；接口温度：260℃；离子源温度：230℃；电离电压：70eV；四极杆温度：150℃；溶剂延迟时间：6min；扫描方式：50—450m/z。步骤(3)中：根据保留时间和质谱图在NIST、HMDB及Metline软件上进行鉴定，得到了十六烷酸、十八烷酸、十八烯酸和十八碳二烯酸。然后在MetaboAnalyst在线软件中进行分析，并最终得到相关代谢通路。进一步地，步骤(3)中包括：(1)利用XCMS在线数据处理软件对得到的原始数据进行处理(2)单维统计与多维统计相结合探究组别之间代谢差异(3)筛选并鉴定出对差异贡献大的变量并对其进行分析(4)利用MetaboAnalyst在线软件对代谢通路进行分析。利用XCMS在线数据处理软件和MetaboAnalyst在线软件分析得到相关的生物标记物有十六烷酸、十八烷酸、十八烯酸和亚油酸，其中亚油酸的显著性差异最好。具体实施方式实施例1大鼠脑缺血-再灌注模型制备与给药溶液的制备：称取水合氯醛，精密称定。置于250ml量瓶中，以纯净水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为3.5％的水合氯醛溶液。于4℃下保存，备用。大鼠脑缺血-再灌注模型制备：采用改进Longa的线栓法制备大鼠脑缺血-再灌注模型。大鼠经过3.5％水合氯醛溶液(1ml/100g)腹腔注射给药麻醉后，仰卧固定于鼠板上。将手术区皮肤进行常规消毒，颈正中切口，用止血钳钝性分离颈前正中肌肉和结缔组织，分离右侧颈内动脉，颈外动脉和颈总动脉。于近心端和颈总动脉分支处分别结扎颈总动脉和颈外动脉，固定颈总动脉，在距离分支约0.5cm处向头方向斜向下45度剪一小口，将头端直径0.26mm的尼龙线栓由颈总动脉缓慢插入颈内动脉。线栓推进至距颈总动脉分叉处约18mm，遇到一定阻力停止进线，结扎固定线栓防止划出。缝合皮肤，将大鼠侧卧于单笼内，保温。2h后拔出线栓并剪掉留于外部的线栓，实现再灌注。造模大鼠清醒后进行行为学评分，出现不能伸展对侧前肢、行走时向对侧转圈追尾或行走时向对侧倾倒三者之一的现象即为造模成功。将造模成功的大鼠随机分成四组(n＝6)：银杏叶分散片组(A)(按黄酮醇苷计12mg/kg)、尼莫地平片组(B)(25mg/kg)、联合给药组(C)(剂量同单独给药组)和模型组(D)。另制备假手术组(E)，除不插入线栓外其余操作同与脑缺血-再灌注模型制备过程。实验过程中出现大鼠死亡情况，均按照同样造模方式补全。实施例2脑缺血再灌注大鼠药物治疗灌胃液的制备：将银杏叶分散片和尼莫地平片分别研细，称取适量，加适量0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，分别配制成银杏叶分散片(以黄酮醇苷计6.28mg/ml)和尼莫地平(1.19mg/ml)的混悬液用于灌胃。给药方案：大鼠造模完成后24h按照分组进行给药，模型组和假手术组给予同样剂量(0.9ml/100g)的生理盐水，连续给药一周。实施例3生物样品收集与预处理血浆样品收集与预处理：末次给药24h后从大鼠眶下静脉取血液约1.0ml置于已预先肝素化的试管中，离心(4℃,5000rpm)5min分离含药血浆，置于-80℃保存。取100μL血浆样本，加入5μL抗氧化剂BHT(1.00mg/mL)，混匀。加入10μL内标(10mg/mL正十三烷酸)混匀，加入2mL5％H2SO4-CH3OH,涡旋30s后于70℃水浴60min进行衍生化反应。冷却10min后，加入正己烷与饱和氯化钠溶液各1mL，涡旋2min，5000r/min离心，5min后取上层正己烷。重复操作一次，合并两次上清液，于室温下N2吹干，用400μL正己烷复溶后进行GC/MS分析。实施例4方法学验证质量控制(QC)样品的制备：等量混合各组大鼠血浆样品共1mL，涡旋3min，分装成每离心管中含100μL混合血浆，同实际生物样品相同处理方法，进样得到质控样品原始数据结果。选取色谱图上不同质荷比和保留时间，且峰型较好、峰强度较高的6个共有色谱峰(m/z_RT：197.2_7.45、255.2_17.83、110.1_20.24、228.1_12.46、150.1_29.52、74.0_10.44)作为方法学的考察对象，以色谱峰峰强度的相对标准偏差(RSD)作为方法学验证指标，对仪器精密度、方法重复性和样品稳定性进行考察。仪器精密度试验：取血浆QC样品按照[0012]项下方法处理，同一QC样品连续进样5针，计算得到各共有峰相应峰强度的RSD值在0.68-4.65％之间。方法重复性试验：取同一血浆QC样本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于GC‑MS联用技术的脑缺血再灌注代谢组学研究的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)血浆样品预处理；(2)GC‑MS联用技术对血浆样品进行检测；(3)对数据进行分析：进行代谢物鉴定并找出最终的差异代谢物，通过在线分析软件对差异代谢物进行通路分析。
【技术特征摘要】
1.一种基于GC-MS联用技术的脑缺血再灌注代谢组学研究的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)血浆样品预处理；(2)GC-MS联用技术对血浆样品进行检测；(3)对数据进行分析：进行代谢物鉴定并找出最终的差异代谢物，通过在线分析软件对差异代谢物进行通路分析。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的样品通过如下方法处理：取血浆样本，加入抗氧化剂BHT，混匀。加入内标正十三烷酸，混匀，5％H2SO4-CH3OH,进行衍生化反应。冷却后，加入正己烷与饱和氯化钠溶液，涡旋，离心，取上层正己烷。重复操作一次，合并两次上清液，于室温下N2吹干，用正己烷复溶。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件：色谱柱：AgilentVF-WAXms毛细管色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm；升温程序：初始温度100℃，以30℃/min升至180℃，再以2℃/min升至198℃，以1℃/min升至205℃，以2℃/min升至230℃，以,10℃/min升温至245℃,再以10℃/min...
【专利技术属性】
技术研发人员：张铭洋，刘然，李清，毕开顺，韩克非，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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