一种荧光交错差分显微成像的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种荧光交错差分显微成像的方法，包括步骤：1)将激光光束准直并转换为线偏光，所述线偏振光在相位调制后投射在待测样品进行扫描成像；相位调制图案为全零相位图；2)收集所述待测样品在二维扫描过程中激发的荧光信号Is(x，y)，其中x,y为待测样品上扫描点的二维坐标；3)将步骤1)中的相位调制图案切换为涡旋相位图，4)收集所述待测样品在二维扫描过程中激发的荧光信号Ih(x，y)；5)重复步骤1)至步骤4)，获得2n个待测样品激发的荧光信号，相邻两次扫描获得的荧光信号光强交错差分计算得到一个时间序列的荧光交错差分信号光强I(x，y)，计算公式为I(x，y)＝Is(x，y)–βIh(x，y)，β为经验参数。本发明专利技术还公开一种荧光交错差分显微成像的装置。

A fluorescence staggered differential microscopy imaging method and device

【技术实现步骤摘要】
一种荧光交错差分显微成像的方法和装置
本专利技术属于超分辨显微成像领域，特别涉及一种荧光交错差分显微成像的方法和装置。
技术介绍
光学显微镜作为科学研究观察的工具，一直以来在化学、生物以及材料等领域发挥了重要作用，为人们观测微观结构及其运动提供了极大的便利。然而，阿贝衍射极限的存在使得成像结果的空间分辨率最高只能达到激发光波长的一半，这给人们对更细微结构进行观察带来了障碍。因此人们提出了各种超分辨方法来突破衍射极限，而激光共聚焦扫描显微成像技术在其中应用最为广泛，它的横向分辨率理论上能够达到衍射极限的1.4倍，同时还具有优秀的光切片能力，能够滤除焦平面之外的荧光，从而提高成像结果的信噪比。公开号为CN102735617B的专利技术专利提供一种超分辨显微方法和装置，在激光共聚焦扫描显微成像技术的基础上提出了空间分辨率更高的荧光发射差分显微成像技术。其先用一个实心光斑扫描样品并收集激发的荧光信号，再将该实心光斑调制为空心光斑之后扫描样品并收集激发的荧光信号，最后将两个荧光信号进行差分，从而得到空间分辨率远高于激光共聚焦扫描显微成像技术的成像结果。但是这种技术受到成像速度的限制，因为其需要两张原始图像才能获得一张超分辨图像，也就是成像速度为激光共聚焦扫描显微成像技术的一半。因此在进行显微成像时需要一种方法能够在不降低成像速度的前提下提高激光共聚焦扫描显微成像技术的空间分辨率。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供一种荧光交错差分显微成像的方法，利用该方法可以兼具激光共聚焦扫描显微成像技术的高时间分辨率和荧光发射差分显微成像技术的高空间分辨率的优点。本专利技术改进了上述荧光发射差分显微成像方法的缺陷，采用交错差分的方式重建超分辨图像，例如，将第一张原始图像与第二张原始图像进行差分获得第一张超分辨图像，再用第三张原始图像和第二张原始图像(而不是第四张原始图像)进行差分获得第二张超分辨图像，然后用同样的方法重建出剩下的超分辨图像。通过使用该方法，对于n张原始图像，我们最后获得了n-1张空间分辨率大大提升的荧光交错差分显微成像结果，与原始图像的帧数基本相同，也就是说时间分辨率是普通荧光差分显微成像的两倍。为了实现上述目的，本专利技术提供的荧光交错差分显微成像的方法包括以下步骤：1)将激光器发出的激光光束准直并转换为线偏光；2)对所述线偏振光进行相位调制，调制图案为全零相位图，调制函数为f1(r,θ)＝0，其中r为到光轴的距离，θ为极坐标矢量与极轴的夹角；3)将所述相位调制后的线偏光转换为圆偏光；4)所述圆偏振光投射在待测样品上，并在二维扫描振镜系统的控制下对样品进行扫描成像；5)使用探测器收集所述待测样品在二维扫描过程中激发的荧光信号Is1(x，y)，其中x，y为待测样品上扫描点的二维坐标；6)将步骤2)中的调制图案切换为涡旋相位图，其调制函数为f1(r,θ)＝θ，其中r为到光轴的距离，θ为极坐标矢量与极轴的夹角；7)重复步骤3)，步骤4)，使用探测器再次收集所述待测样品在二维扫描过程中激发的荧光信号Ih1(x，y)，其中x，y为待测样品上扫描点的二维坐标；8)不断重复步骤2)至步骤7)，最后获得2n个待测样品激发的荧光信号，其中Is1(x，y)到Isn(x，y)为在全零相位图调制下获得的荧光信号，Ih1(x，y)到Ihn(x，y)为在涡旋相位图调制下获得的荧光信号。9)通过相邻两次扫描获得的荧光信号光强交错差分计算得到我们所需的一个时间序列的荧光交错差分信号光强I(x，y)，计算公式为I(x，y)＝Is(x，y)–βIh(x，y)，其中Is(x，y)为在全零相位图调制下获得的荧光信号，Ih(x，y)为在涡旋相位图调制下获得的荧光信号，β为经验参数，一般是设为0.7；其中，所述荧光交错差分信号光强I(x，y)为负时，令其等于零。其中，交错差分计算方法为：第一个荧光交错差分信号I1(x，y)＝Is1(x，y)–βIh1(x，y)，第二个荧光交错差分信号I2(x，y)＝Is2(x，y)–βIh1(x，y)，第三个荧光交错差分信号I3(x，y)＝Is2(x，y)–βIh2(x，y)，以此类推，得到2n-1个荧光交错差分信号I1(x，y)到I2n-1(x，y)；其中，所述线偏光为p偏振光，因为空间光调制器只对p偏振光敏感，调制为p偏振光能够使调制效率最大化。其中，将p偏振光转换为圆偏振光进行扫描是为了使被投射到样品的光斑更均匀。其中，根据需要的像素尺寸设置二维扫描振镜系统的扫描步长，并根据视场设置二维扫描振镜系统的扫描范围。其中，步骤2)中经过空间光调制器调制后的实心激发光束为高斯光束。其中，步骤6)中经过空间光调制器调制后的空心激发光束为环形光束(类似于甜甜圈的形状)。本专利技术的原理如下：将准直激光器发出的激光光束转换为线偏光；对所述线偏振光进行相位调制，调制图案为全零相位图，再将其转换为圆偏振光后投射在待测样品上进行二维扫描；使用探测器收集所述待测样品发出的荧光信号获得荧光信号光强；将调制图案切换为涡旋相位图，再次对所述线偏振光进行相位调制，重复上述步骤再次获得荧光信号光强；不断切换全零相位和涡旋；相位调制图案，直到获得n个荧光信号光强；再采用交错差分的方式重建超分辨图像，例如，将第一个荧光信号光强与第二个荧光信号光强进行差分获得第一个有效荧光信号光强，再用第三个荧光信号光强和第二个荧光信号光强进行差分获得第二个有效荧光信号光强，然后用同样的方法重建出剩下的有效荧光信号光强；最后获得n-1张空间分辨率大大提升的荧光交错差分显微成像结果图像。本专利技术的另一目的为提供一种实现上述方法的一种荧光交错差分显微成像的装置，该装置可用于实现上述方法，使用实心光斑和空心光斑交替扫描样品激发荧光，从而获取一系列不同时刻拍摄的样品图像。一种荧光交错差分显微成像的装置，包括：激光器，用于产生激光光束；准直物镜，用于将所述激光光束准直；起偏器，用于将所述准直后的激光光束转换为线偏振光；二分之一波片，用于将所述线偏振光转换为p偏振光；空间光调制器，用于对所述p偏振光进行相位调制；四分之一波片，用于将所述调制后的p偏振光转换为圆偏振光；二色镜，用于反射所述圆偏振激光光束以及透过样品发出的荧光光束；二维扫描振镜系统，用于改变所述经过二色镜的激光光束的方位角偏转光路实现对样品的二维扫描，并改变所述经过扫描透镜荧光光束的方位角偏转光路实现解扫描；扫描透镜，用于消除所述经过二维扫描振镜系统后的激光光束的畸变，并将所述经过场镜的荧光光束准直和缩束；场镜，用于将所述经过扫描透镜的激光光束进行准直和扩束，并将所述经过显微物镜的荧光光束聚焦；显微物镜，用于将所述经过场镜准直后的激光光束聚焦至样品台，并收集样品台上样品发出的荧光信号；滤光片，用于滤除二色镜透射的杂散光；聚焦透镜，用于将所述经过滤光片的荧光光束聚焦到多模光纤端面；针孔，用于对所述经过聚焦透镜的荧光光束进行空间滤波；多模光纤，用于将所述经过空间滤波的荧光信号耦合至探测器；探测器，用于采集所述荧光信号。还设有用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器，数据采集卡以及用于处理所述荧光信号的计算机；所述圆偏振光是指投射在样品上时为圆偏振光。所述二维扫描振镜系统应与显微物镜入瞳面共轭。所述针孔和多模光纤端面应位于聚焦本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光交错差分显微成像的方法，其特征在于，包括步骤：1)将激光光束准直并转换为线偏光，所述线偏振光在相位调制后投射在待测样品进行扫描成像；相位调制图案为全零相位图，调制函数为f1(r,θ)＝0，其中r为到光轴的距离，θ为极坐标矢量与极轴的夹角；2)收集所述待测样品在二维扫描过程中激发的荧光信号Is(x，y)，其中x,y为待测样品上扫描点的二维坐标；3)将步骤1)中的相位调制图案切换为涡旋相位图，其调制函数为f1(r,θ)＝θ，其中r为到光轴的距离，θ为极坐标矢量与极轴的夹角；4)收集所述待测样品在二维扫描过程中激发的荧光信号Ih(x，y)，其中x,y为待测样品上扫描点的二维坐标；5)重复步骤1)至步骤4)，获得2n个待测样品激发的荧光信号，相邻两次扫描获得的荧光信号光强交错差分计算得到一个时间序列的荧光交错差分信号光强I(x，y)，计算公式为I(x，y)＝Is(x，y)–βIh(x，y)，β为经验参数。

【技术特征摘要】
1.一种荧光交错差分显微成像的方法，其特征在于，包括步骤：1)将激光光束准直并转换为线偏光，所述线偏振光在相位调制后投射在待测样品进行扫描成像；相位调制图案为全零相位图，调制函数为f1(r,θ)＝0，其中r为到光轴的距离，θ为极坐标矢量与极轴的夹角；2)收集所述待测样品在二维扫描过程中激发的荧光信号Is(x，y)，其中x,y为待测样品上扫描点的二维坐标；3)将步骤1)中的相位调制图案切换为涡旋相位图，其调制函数为f1(r,θ)＝θ，其中r为到光轴的距离，θ为极坐标矢量与极轴的夹角；4)收集所述待测样品在二维扫描过程中激发的荧光信号Ih(x，y)，其中x,y为待测样品上扫描点的二维坐标；5)重复步骤1)至步骤4)，获得2n个待测样品激发的荧光信号，相邻两次扫描获得的荧光信号光强交错差分计算得到一个时间序列的荧光交错差分信号光强I(x，y)，计算公式为I(x，y)＝Is(x，y)–βIh(x，y)，β为经验参数。2.如权利要求1所述的荧光交错差分显微成像的方法，其特征在于，所述荧光交错差分信号光强I(x，y)为负时，令其等于零。3.如权利要求1所述的荧光交错差分显微成像的方法，其特征在于，相位调制后的线偏光转换为圆偏光再投射在待测样品上。4.如权利要求1所述的荧光交错差分显微成像的方法，其特征在于，所述的线偏光为p偏振光。5.如权利要求1所述的荧光交错差分显微成像的方法，其特征在于，步骤1)中，相位调制后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，陈宇宸，张乘风，徐良，刘旭，李海峰，毛磊，张克奇，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33