抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体及其构建方法和应用技术

一种抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体，包括如下核苷酸序列：TTCGGCGGATCTAAC TTTGTCGTGGGAAACGGGGCGGACTTCACACTCGC。本发明专利技术提供的核酸适配体的分子量较小，制备周期短，重现性好，便于体外化学合成，便于标记，序列稳定易于运输和保存。该核酸适配体对草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒具有较高的特异性和亲和力，并且无免疫原性。

Nucleic acid aptamers against grass carp reovirus type I and their construction methods and Applications

【技术实现步骤摘要】
抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
本专利技术属于水产病原菌检测
，具体地，涉及一种抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体及其构建方法和应用。
技术介绍
广西是我国的水产养殖大省，主要养殖品种包括草鱼、斑点叉尾鮰、石斑鱼、草鱼、对虾、牡蛎、马氏珠母贝和各种食用植物。据统计，截止2017年底，广西的渔业经济总产值已超过621亿元，水产养殖总量超过320.76万吨。然而，水产养殖规模的不断扩大和养殖密度的持续增加导致养殖环境恶化，各类水产疫病病原频繁暴发。2018年广西南宁、河池、柳州等地池塘和网箱养殖的草鱼暴发疑似草鱼出血症，通过对患病草鱼中病原微生物进行聚合酶链式反应检测技术(polymerasechainreation,PCR)分析鉴定，证明草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒(Grasscarpreovirus,GCRVⅠ)是主要致病病原。草鱼出血症是草鱼养殖中最常见的病毒病，其致病病原为草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)，又称为草鱼出血病病毒(GCHV)，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属。GCRV病毒作为一种高致病性鱼类传染病毒，通常表现为爆发式感染，即会在极短时间内导致鱼大量死亡。目前GCRV病毒引起的草鱼病毒性出血症在我国广泛存在，严重影响我国的水产养殖业的发展。因此，研发新型高效的抗病毒药物，同时，针对GCRV病毒发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的检测技术，对于防控草鱼GCRV病毒的危害来说至关重要。核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichmenttechnology,SELEX)，在体外经过多轮筛选获得的、能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适配体具有特异性高、亲和性高、稳定性强、易化学合成和化学修饰等诸多优点。目前核酸适配体作为一类新型的、广受关注的新型检测和治疗工具，在人类医学研究、疾病诊断、病毒侵染机制研究等领域展现出广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体及其构建方法和应用，以实现草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的高灵敏、特异性检测。根据本专利技术的一个方面，提供一种抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体：包括SEQIDNO.1的核苷酸序列。优选地，包括SEQIDNO.2的核苷酸序列。优选地，其核苷酸序列上的至少一个核苷酸被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。优选地，其核苷酸序列上结合有标志物，标志物选自荧光物质、发光材料、生物素或酶中的一种或一种以上。优选地，荧光物质选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素或羧基四甲基罗丹明中的一种或一种以上。根据本专利技术的另一个方面，提供一种构建上述抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体的方法，采用SELEX技术，包括以下步骤：(1)建立单链DNA随机文库Library50，单链DNA随机文库Library50的核苷酸序列为：5’-GTCTGAAGTAGACGCAGGAG(50N)AGTCACACCTGAGTAAGCGT；(2)利用草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒感染细胞筛选单链DNA随机文库Library50，得出草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的特异性DNA文库；(3)以特异性DNA文库作为模板，与核苷酸序列为SEQIDNO.3的引物、核苷酸序列为SEQIDNO.4的引物进行PCR扩增。优选地，PCR扩增的扩增程序是：94℃5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃1分钟，25轮循环；72℃5分钟。根据本专利技术的另一个方面，提供上述抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体在检测草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒中的应用。根据本专利技术的另一个方面，提供一种草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的荧光定量PCR快速检测试剂盒：包括荧光分子检测探针，以上述抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体作为荧光分子检测探针，标志物为羟基荧光素。本专利技术提供的抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体的分子量较小，制备周期短，重现性好，便于体外化学合成，便于标记，序列稳定易于运输和保存。该核酸适配体对草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒具有较高的特异性和亲和力，并且无免疫原性。另外，组成该核酸适配体的核苷酸序列容易被取代或修饰。经部分取代或者经过修饰后的上述核酸适配体能够保持与原核酸适配体基本相同或者类似的分子结构、理化性质和功能，同样能够有效实现草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的检测。利用羟基荧光素标记本专利技术提供的核酸适配体，由此，将该核酸适配体制作成荧光探针，将其与实时荧光定量PCR检测技术相结合，能够实现对草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的高特异性、高灵敏度的实时定性、定量检测。附图说明图1为核苷酸序列为SEQIDNO.2的抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体的二级结构预测图；图2为实施例2中流式细胞仪检测的样品FAM荧光值测试结果；图3为实施例2中激光扫描共聚焦显微镜的观测结果：(a)对照组样品的光镜图，(b)对照组样品的荧光图，(c)试验组样品的光镜图，(d)试验组样品的荧光图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。实施例1检测抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体的筛选和制备S1.随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物的合成构建随机ssDNA文库Library50，两端为固定序列，中间50个核苷酸为随机序列，其核苷酸序列如下：5’-GTCTGAAGTAGACGCAGGAG(50N)AGTCACACCTGAGTAAGCGT。5’引物(SEQIDNO.3)：5’-FAM-GTCTGAAGTAGACGCAGGAG-3’。3’引物(SEQIDNO.4)：5’-Biotin-ACGCTTACTCAGGTGTGACT-3’。随机ssDNA文库和引物均由上海生工生物有限公司合成。S2.SELEX筛选(相当于阳性筛选)将10nmol上述随机ssDNA文库溶解在500μLPBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的随机ssDNA文库与草鱼GCRVⅠ型病毒感染细胞在冰上孵育1h。孵育结合完成后，离心移除上清，用10mL的经过PBS洗涤草鱼GCRVⅠ型病毒感染细胞，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为特异性识别草鱼GCRVⅠ型病毒感染细胞的ssDNA核酸文库。S3.PCR扩增取100μL筛选得到的识别草鱼GCRVⅠ型病毒感染细胞的ssDNA文库和5’引物、3’引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下(1000μL)：10×Buffer100μL,dNTPMix(2.5mM)80μL，SEQIDNO.3的引物40μL，SEQIDNO.4的引物，ssDNA文库100μL，rTaq酶12.5μL，ddH2O627.5μL。PCR的扩增程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过25轮循环；72℃5min。第一轮SELEX筛选后得到的上清，要全部用于进行PCR扩增，扩增后得到双链核酸(dsDNA)文库。S4.ssDNA文库的制备将100μL链酶亲和素标记的磁珠与S3制得的dsDNA文库在常温下孵育20min，利用dsDNA上的生物素与磁珠上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体，其特征在于：包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体，其特征在于：包括SEQIDNO.1的核苷酸序列。2.如权利要求1所述抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体，其特征在于：包括SEQIDNO.2的核苷酸序列。3.如权利要求1所述抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列上的至少一个核苷酸被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。4.如权利要求1–3任一项所述抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列上结合有标志物，所述标志物选自荧光物质、发光材料、生物素或酶中的一种或一种以上。5.如权利要求4所述抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体，其特征在于：所述荧光物质选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素或羧基四甲基罗丹明中的一种或一种以上。6.一种构建如权利要求1或2任一项所述抗草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的核酸适配体的方法，其特征在于，采用SELEX技术，包括以下步骤：(1)建立单链DNA随机文库Library50，所述单链DNA随机文库Library50的核苷酸序列为：5’-GTCTGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明珠，李鹏飞，余庆，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：广西,45