一种高效固定化酶柱及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种高效固定化酶柱及其制备方法和应用，高效固定化酶柱包含多孔基材和活性生物酶，多孔基材的孔结构同时分布有大孔，中孔和小孔，大孔，中孔和小孔互相连通形成三维贯通结构，三维贯通结构表面通过戊二醛交联法固定有活性生物酶，多孔基材由多孔碳性材料粉末负载琼脂糖凝胶制备，原位装填冷凝于柱状模具中，可固定负载蛋白酶，乳糖酶，脂肪酶，淀粉酶等多种活性生物酶，多孔基材载酶量为133～216IU/g。多孔碳性材料提供极大的比表面积，交联生物酶后可以获得较高的载酶量，并保证长时间酶解处理后保持生物酶有较高的生物活性，可满足酶解处理稳定性和连续性的要求，大幅提高生物酶处理的生产效率。

【技术实现步骤摘要】
一种高效固定化酶柱及其制备方法和应用
本专利技术涉及固定化酶领域，特别涉及一种高效固定化酶柱及其制备方法和应用。
技术介绍
酶的固定化是指利用一些载体材料将酶束缚或者限制于一定的区域内，酶仍然能进行其特有的催化反应，并且能被回收和重复使用的一类技术。而固定化酶是指在一定的空间内，呈闭锁状态，并仍然能保留其催化活力，可以连续或重复利用的酶在酶的固定化反应中，使用最普遍的交联剂是戊二醛，因为其具有两个功能活性的醛基。在反应过程中，戊二醛的一个醛基会与载体表面壳聚糖的-NH2和-OH发生交联，而其另一个具有功能活性的醛基，会与酶分子表面的-NH2和-OH进行交联，这样戊二醛作为交联剂，就成功的将酶固定在载体上了。当然，在反应过程中，也会出现载体与载体之间的交联、酶与酶之间的交联以及戊二醛本身的交联反应，这就需要严格控制反应条件，尽可能多的使酶固定在载体上，以提高酶的固定化效率。载体是固定化技术的关键，因此，理想的固定化载体应该具备如下特性:(1)对生物无毒性；(2)性质稳定，不易被微生物分解，并且在固定化的过程中不易引起生物酶变性；(3)传质性能良好；(4)机械强度高，使用寿命长；(5)固定化操作简便；(6)价格低廉。常用的天然高分子凝胶载体有海藻酸钠、琼脂、纤维素、壳聚糖等；而有机高分子载体的代表有：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚矾、光交联树脂、硅胶、聚氨酯等。其中，有机高分子载体一般化学稳定性较好，强度较高，但是传质性能较差。而天然高分子载体一般对生物无毒，传质性能良好，但强度较低。琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。竹炭是由竹材在高温无氧或少氧环境下，经过热解得到的产物。竹材热解成竹炭的过程一般可分为干燥阶段、预炭化阶段、炭化阶段和锻烧阶段。竹炭即是在炭化阶段得到的产物，因其独特的孔道结构而具备着很多优异的性能。竹炭具备有丰富的孔道结构，低倍下呈现“品”字形，是一种兼具有微孔、介孔和大孔的阶层多孔炭材料，大孔为直通孔，孔道中布满微孔与介孔，使其具有较大的比表面积。竹炭丰富的孔隙和高比表面积使其具备良好的吸附特性。酶在紧紧结合于载体上以后，载体所造成的扩散因素便成为了酶反应动力学的限制因素。底物与固定化酶接触发生反应，由于酶的催化作用引起固定化酶颗粒中的底物浓度逐渐降低，同时载体的空间位阻又妨碍新的底物进入到固定化酶，因而固定化酶必须在相对于游离酶更高的底物浓度下才能达到最大的反应速度。这一点在酶的动力学上表现为固定化酶的米氏常数通常比游离酶的米氏常数要高，因此固定化酶对低浓度底物的处理效果不理想，处理时间较长。除此之外，传统固定化酶的单次酶解需要搅拌和反应等待时间，以增加底物与固定化酶的接触面积和充分进行酶解反应，单次反应完成后需要分离固定化酶和底物才能重复利用固定化酶，效率较低，无法多次连续生产。另外，固定化酶载体比表面积较小，与底物的接触面积较小，酶解催化效率不尽如人意。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题：针对目前固定化酶及制备过程中存在的多种缺陷，本专利技术提供一种高效固定化酶柱，拥有优越的孔道特性，比表面积大，孔道表面交联固定酶分子，增加载酶量，提高酶解率，解决固定化酶的连续反应问题。克服目前颗粒、薄膜状固定化酶存在的孔径分布单一、物质快速输送与高表面活性不兼容、多孔材料使用不方便等诸多问题。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下的技术方案：一种高效固定化酶柱，包含多孔基材和活性生物酶，所述多孔基材的孔结构同时分布有大孔，中孔和小孔，所述大孔，中孔和小孔互相连通形成三维贯通结构，三维贯通结构表面通过戊二醛交联法固定有活性生物酶，多孔基材由多孔碳性材料粉末负载琼脂糖凝胶制备，原位装填冷凝于柱状模具中，所述活性生物酶为蛋白酶，乳糖酶，脂肪酶，淀粉酶中的一种或多种，所述多孔基材载酶量为133～216IU/g。优选地，所述大孔孔径30～80μm，所述中孔孔径2～10μm，小孔孔径200～300nm，所述多孔碳性材料为竹炭、木炭、草炭中的一种。一种上述高效固定化酶柱的制备方法，包含如下具体步骤：(1)取3～5年毛竹主干、白茅草老化草秆或木材中的一种为原料，在氮气气氛下以6～9℃/min升温至炭化温度700～900℃，保温炭化2h得多孔碳性材料，将多孔碳性材料粉碎后过30～50目筛备用；(2)称取琼脂糖干粉，余量为纯水，将琼脂糖干粉加入纯水中混匀后加热至90℃充分混匀后，60～70℃保温备用，按上述方法分别配制0.05～0.3wt％琼脂糖溶液和1.0～1.5wt％琼脂糖溶液；(3)在0.05～0.3wt％琼脂糖溶液中边搅拌边加入多孔碳性材料粉末，充分搅拌混匀并于60～70℃浸润6～18h，抽滤去除琼脂糖溶液，于15℃将多孔碳性材料浸入3倍重量的65％乙醇溶液中脱水，10min后抽滤去除乙醇，45～65％湿度下完全挥发乙醇后密封保存多孔碳性材料备用；(4)步骤(3)中制备的多孔碳性材料按1～5g：5mL的料液比加入1.0～1.5wt％琼脂糖溶液中，充分搅拌后填装入预热至60～70℃的柱状模具，将模具立于50℃水中，40～60kHz频率超声处理15～30min除气，取出模具自然冷却至室温，密封模具，在模具两端设置进料管和出料管，模具内的冷凝物即为多孔基材；(5)30℃下将0.3～0.6wt％戊二醛溶液循环泵入多孔基材，持续4～6h，再以恒定流速泵入10倍柱体积磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液冲洗多孔基材，将1～10mg/mL活性生物酶液采用恒流泵循环泵入模具中进行载酶，持续1～3h，随后采用10～20mg/mL甘氨酸恒流冲洗中和未反应的戊二醛；(6)冲洗中和后即得根据活性生物酶的种类选择缓冲溶液平衡，调节pH至最大酶活状态，4℃保存即得高效固定化酶柱。优选地，所述多孔基材的填充量为柱状模具容积的70～90％，所述柱状模具内径与长度比为1:10～20。优选地，所述步骤(1)还包括碱腐蚀扩孔步骤，具体如下：(1)以30～50目的多孔碳性材料为原料，按碱碳质量比1～5：1加入KOH水溶液，浸泡24h后，在150℃的烘箱里干燥24小时；(2)干燥后取出样品置于坩埚中，将坩埚放在管式气氛炉中，用塞子将两端塞住，接好管子后在氮气气氛下活化，氮气的流量控制在5dm3/min,10℃/min升至800℃，升温至800℃后保温活化1h；(3)活化完成后取出用盐酸酸洗至接近中性并用纯水抽滤冲洗3～4遍，抽滤完成后置于烘箱中烘干进行后续操作。优选地，所述琼脂糖溶液配制时加入1～3wt％的PEG4000或PEG6000；所述KOH水溶液中KOH浓度为0.5～3M。一种应用上述高效固定化酶柱进行固定化酶水解加工的方法，包含如下具体步骤：(1)采用缓冲液平衡柱状模具中的固定化酶柱，采用1M盐酸或NaOH调整pH至6～10，同时升高柱温至30～40℃；(2)液体均质原料加热至30～40℃，保证流体粘度≤80厘泊，以15～30mL/min的速度恒流泵入液体原料，柱压维持在5～20MPa，出料口收集水解产物，测定酶解率；(3)根据酶解率调整参数以达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效固定化酶柱，其特征在于：包含多孔基材和活性生物酶，所述多孔基材的孔结构同时分布有大孔，中孔和小孔，所述大孔，中孔和小孔互相连通形成三维贯通结构，三维贯通结构表面通过戊二醛交联法固定有活性生物酶，多孔基材由多孔碳性材料粉末负载琼脂糖凝胶制备，原位装填冷凝于柱状模具中，所述活性生物酶为蛋白酶，乳糖酶，脂肪酶，淀粉酶中的一种或多种，所述多孔基材载酶量为133～216IU/g。

【技术特征摘要】
1.一种高效固定化酶柱，其特征在于：包含多孔基材和活性生物酶，所述多孔基材的孔结构同时分布有大孔，中孔和小孔，所述大孔，中孔和小孔互相连通形成三维贯通结构，三维贯通结构表面通过戊二醛交联法固定有活性生物酶，多孔基材由多孔碳性材料粉末负载琼脂糖凝胶制备，原位装填冷凝于柱状模具中，所述活性生物酶为蛋白酶，乳糖酶，脂肪酶，淀粉酶中的一种或多种，所述多孔基材载酶量为133～216IU/g。2.根据权利要求1中所述的一种高效固定化酶柱，其特征在于：所述大孔孔径30～80μm，所述中孔孔径2～10μm，小孔孔径200～300nm，所述多孔碳性材料为竹炭、木炭、草炭中的一种。3.一种如权利要求1和2中所述高效固定化酶柱的制备方法，其特征在于，包含如下具体步骤：(1)取3～5年毛竹主干、白茅草老化草秆或木材中的一种为原料，在氮气气氛下以6～9℃/min升温至炭化温度700～900℃，保温炭化2h得多孔碳性材料，将多孔碳性材料粉碎后过30～50目筛备用；(2)称取琼脂糖干粉，余量为纯水，将琼脂糖干粉加入纯水中混匀后加热至90℃充分混匀后，60～70℃保温备用，按上述方法分别配制0.05～0.3wt％琼脂糖溶液和1.0～1.5wt％琼脂糖溶液；(3)在0.05～0.3wt％琼脂糖溶液中边搅拌边加入多孔碳性材料粉末，充分搅拌混匀并于60～70℃浸润6～18h，抽滤去除琼脂糖溶液，于15℃将多孔碳性材料浸入3倍重量的65％乙醇溶液中脱水，10min后抽滤去除乙醇，45～65％湿度下完全挥发乙醇后密封保存多孔碳性材料备用；(4)步骤(3)中制备的多孔碳性材料按1～5g：5mL的料液比加入1.0～1.5wt％琼脂糖溶液中，充分搅拌后填装入预热至60～70℃的柱状模具，将模具立于50℃水中，40～60kHz频率超声处理15～30min除气，取出模具自然冷却至室温，密封模具，在模具两端设置进料管和出料管，模具内的冷凝物即为多孔基材；(5)30℃下将0.3～0.6wt％戊二醛溶液循环泵入多孔基材，持续4～6h，再以恒定流速泵入10倍柱体积磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液冲洗多孔基材，将1～10mg/mL活性生物酶液采用恒流泵循环泵入模具...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙有俊，孙冬梅，范彩云，鲍芳丽，
申请(专利权)人：南京萌萌菌业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32