本发明专利技术属于环境监测技术领域，提供一种提高辣根过氧化物酶稳定性的固定化酶方法及应用。在常温常压下，利用共沉淀的方法，在水相中合成沸石咪唑酯骨架‑8/石墨烯固定化天然辣根过氧化物酶的生物复合材料。ZIF‑8/GO复合材料的包埋保留HRP优异的过氧化物酶催化活性，同时增强HRP的稳定性。相对于单独的ZIF‑8矿化HRP材料来说，GO的引入增加了HRP对抗高温、有机溶剂和变性剂等复杂环境的耐受性，同时增强了HRP的存储稳定性和回收利用能力。利用DNA分子调控HRP@ZIF‑8/GO生物复合材料的过氧化物酶催化活性，建立了无标记的比色传感方法，实现了卡那霉素的特异性检测。
An Immobilized Enzyme Method for Improving the Stability of Horseradish Peroxidase and Its Application
【技术实现步骤摘要】
一种提高辣根过氧化物酶稳定性的固定化酶方法及应用
本专利技术属于环境监测
，涉及一种提高辣根过氧化物酶稳定性的固定化酶方法及应用。
技术介绍
天然酶是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。天然酶具有来源广泛、种类繁多、底物亲和力好、催化效率高等优点，广泛地应用于催化分析、疾病诊断、临床治疗等生产生活的各个方面。但是作为一类典型的生物分子，天然酶的稳定性相对较差，易受外界环境的影响，而且对存储条件有严格的要求。例如天然酶极易受到高温、强酸、强碱等极端外界条件的破坏而丧失部分功能甚至失去原有活性。随着纳米技术的迅速发展，近些年，结合纳米材料的稳定性，利用纳米材料固定化天然酶等生物分子已经成为新的研究热点(Small,2017,13(32):1700880)。固定化酶是指酶在物理上被限制或定位于一定的空间区域内，其催化活性保持不变。固定化酶技术能更有效地控制反应过程，提高酶的存储能力和在极端操作条件下的稳定性。此外，固定化酶的多级结构使其更容易分离，最大限度地减少污染，实现回收利用等，以降低生产成本。目前，常用的纳米材料固定化酶手段有溶胶-凝胶基质、水凝胶、有机微粒、介孔二氧化硅、金属有机骨架(MOFs)材料等等，这些多孔材料具有较大的表面积和空隙体积，是酶固定化的理想材料(MaterialsHorizons,2017,4(1):55-63；PhysicalChemistryChemicalPhysics,2018,20(13):8822-8831；NatureCatalysis,2018,1(9):689-695)。但另一方面，这些材料自身的催化性能较差，在固定酶后，往往抑制了天然酶的部分活性(JournaloftheAmericanChemicalSociety,2017,139(19):6530-6533；JournaloftheAmericanChemicalSociety,2015,137(13):4276-4279)。本专利技术中结合了沸石咪唑酯骨架材料(ZIFs)的多孔结构和石墨烯(GO)材料优异的稳定性，利用沸石咪唑酯骨架-8/石墨烯复合材料(ZIF-8/GO)实现了天然辣根过氧化物酶(HRP)的固定(HRP@ZIF-8/GO)。沸石咪唑酯骨架结构(ZIFs)材料作为MOFs材料的一类，是由过渡金属原子与咪唑或咪唑衍生物连接而生成的一类新型的、具有沸石拓扑结构的多孔材料，为固定化天然酶提供了有效的结合位点。ZIFs不仅具有MOFs的优点，而且同MOFs材料相比，具有更优良的热稳定性和水溶液稳定性。石墨烯材料作为典型的碳材料，不仅具有丰富的含氧官能团和π电子共轭区域，还具有较高的环境稳定性，其表面丰富的官能团可以提供共价或非共价结合的反应位点，为构建多级结构奠定了基础。基于沸石咪唑酯骨架-8/石墨烯复合材料构建的多级结构内部具有相互交联的多孔结构，可以为天然酶提供更多的结合位点，增强天然酶抗冲击负荷的能力，进一步提升天然酶的环境稳定性。此外，通过利用DNA分子调控HRP@ZIF-8/GO生物复合材料的过氧化物酶催化活性，建立了一种通用型的比色分析方法用于卡那霉素(KAN)的检测。
技术实现思路
本专利技术解决了天然酶存在的稳定性不足等缺陷，通过沸石咪唑酯骨架-8/石墨烯复合材料(ZIF-8/GO)实现了天然辣根过氧化物酶的固定(HRP@ZIF-8/GO)，并将其应用于卡那霉素(KAN)的比色检测。本专利技术中，在常温常压下合成了ZIF-8/GO纳米复合材料固定化HRP的生物复合材料。ZIF-8/GO矿化的技术手段能够保留了HRP原有的过氧化物酶催化活性。相对于ZIF-8矿化HRP或游离的HRP来说，ZIF-8/GO保护层增加了HRP对抗极端环境如水解蛋白酶、高温和有机溶剂等的耐受性，还可以有效地提高天然酶的存储稳定性以及回收利用性能，这种保护性能随复合材料中GO含量的增加而逐渐增强，充分说明GO的引入可以在一定程度上弥补ZIF-8骨架结构稳定性不足的缺点，进一步增强天然酶的稳定性。此外，利用DNA分子可以调控HRP@ZIF-8/GO催化活性这一特征，建立了基于HRP@ZIF-8/GO生物复合材料的无标记比色传感方法，反应体系的吸光度变化在一定范围内与卡那霉素的浓度正相关，从而为抗生素的定量分析提供依据。本专利技术的技术方案：一种提高辣根过氧化物酶稳定性的固定化酶方法，步骤如下：(1)制备氧化石墨烯：石墨烯氧化物采用改进的Hummers化学法制备。步骤如下：取一定量的浓硫酸(98％)缓慢加入到石墨粉(浓硫酸体积:石墨粉质量＝23:1)中，充分搅拌后，在0℃冰水浴中缓慢加入KMnO4(KMnO4与石墨粉质量比为3:1)，同时充分搅拌。然后将混合物连续超声5-7h后，得到深褐色溶液。向深褐色溶液中缓慢加入高纯水，加热煮沸5-15min后，依次加入高纯水和30％的过氧化氢(H2O2)终止反应，得到亮黄色的石墨烯氧化物水溶液。离心分离后，用稀盐酸在8000-10000r/min的条件下离心洗涤2-3次去除杂质，然后用高纯水在8000-10000r/min的条件下离心洗涤5-7次去除杂质。洗涤后取出纯化的石墨氧化物，装入透析袋(MW＝14000)透析5-7天以进一步去除杂质，最后冷冻干燥得到固体氧化石墨烯。(2)制备沸石咪唑酯骨架-8/石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶(HRP@ZIF-8/GO)：氧化石墨烯(GO)与硝酸锌(Zn(NO3)2)在水中充分超声混合，形成混合液A；HRP和2-甲基咪唑溶于水中，形成混合液B；之后，将混合液B快速倒入混合液A中，得到的混合液在室温下搅拌12-24h；其中GO和HRP的质量比为在0:50-1:1，HRP质量、Zn(NO3)2的摩尔和2-甲基咪唑的摩尔量三者比例为5g:100mol:7000mol；将得到的混合物用高纯水离心清洗3-5次，冷冻干燥12-24h后得到粉末状物质，将其研磨并置于-4～-20℃的条件下冷冻保存；得到的不同GO含量的产物命名为HRP@ZIF-8/GO-x，其中x代表加入的GO在最终产物中的质量。一种提高辣根过氧化物酶稳定性的固定化酶的应用，卡那霉素(KAN)的定量检测：在25-35℃温度条件下，将浓度为0-50μg/L的KAN溶液与KAN适配体溶液置于HEPES缓冲液(10-25mM，pH＝7-8)中孵化20-30min；随后向混合液中加入HRP@ZIF-8/GO-x复合物在25-35℃下继续孵化20-30min，其中HRP@ZIF-8/GO-x复合物的质量与KAN适配体摩尔量的比值为14×106g:214mol；之后，再加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和H2O2，其中KAN适配体、TMB和H2O2三者的摩尔比214:50:11。混合物在25-37℃下反应10-30min后，转移到石英比色皿中，记录体系吸光度随吸收波长的变化曲线。所述的适配体序列为5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3'。本专利技术的有益效果：(1)当加入的GO比例为最终产物质量的4％，适配体浓度为2.14μM，HRP@ZIF-8/GO复合物浓度为0.14mg/mL，孵化和温度分别为20min和25℃，反应时间和温度分别为1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高辣根过氧化物酶稳定性的固定化酶方法，其特征在于，步骤如下：(1)制备氧化石墨烯：石墨烯氧化物采用改进的Hummers化学法制备；(2)制备沸石咪唑酯骨架‑8/石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶HRP@ZIF‑8/GO：GO与Zn(NO3)2在水中充分超声混合，形成混合液A；HRP和2‑甲基咪唑溶于水中，形成混合液B；之后，将混合液B快速倒入混合液A中，得到的混合液在室温下搅拌12‑24h；其中GO和HRP的质量比为0:50‑1:1，HRP质量、Zn(NO3)2的摩尔和2‑甲基咪唑的摩尔三者比例为5g:100mol:7000mol；将得到的混合物用高纯水离心清洗3‑5次，冷冻干燥12‑24h后得到粉末状物质，将其研磨并置于‑4～‑20℃的条件下冷冻保存；得到的不同GO含量的产物命名为HRP@ZIF‑8/GO‑x，其中x代表加入的GO在最终产物中的质量百分比。
【技术特征摘要】
1.一种提高辣根过氧化物酶稳定性的固定化酶方法，其特征在于，步骤如下：(1)制备氧化石墨烯：石墨烯氧化物采用改进的Hummers化学法制备；(2)制备沸石咪唑酯骨架-8/石墨烯复合材料固定化辣根过氧化物酶HRP@ZIF-8/GO：GO与Zn(NO3)2在水中充分超声混合，形成混合液A；HRP和2-甲基咪唑溶于水中，形成混合液B；之后，将混合液B快速倒入混合液A中，得到的混合液在室温下搅拌12-24h；其中GO和HRP的质量比为0:50-1:1，HRP质量、Zn(NO3)2的摩尔和2-甲基咪唑的摩尔三者比例为5g:100mol:7000mol；将得到的混合物用高纯水离心清洗3-5次，冷冻干燥12-24h后得到粉末状物质，将其研磨并置于-4～-20℃的条件下冷冻保存；得到的不同GO含量的产物命名为HRP@ZIF-8/GO-x，其中x代表加入的GO在最终产物中的质量百分...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵慧敏，谭冰，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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