一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法：将珍珠粉加入到酸溶液中进行酸解，收集上清液和第一不溶性蛋白；对第一不溶性蛋白进行水冲泡后离心得到第二上清液和第二不溶性蛋白；合并第一上清液和第二上清液；对合并后的第一上清液和第二上清液进行真空热浓缩析出乳酸钙，过滤后与第二不溶性蛋白混合，匀浆制成匀浆液；使用复合蛋白酶液对匀浆液在弱酸性条件下进行酶解，得到酶解液，所述复合蛋白酶液包括胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液；对酶解液进行脱色和灭菌，制成液体或粉末形态的小分子活性肽。本发明专利技术提供的方法所提取出来的小分子活性肽具有高活性和针对性，对酪氨酸酶抑制率高，具有美白功效。

A Method of Extracting Small Molecular Active Peptides from Pearl Powder by Complex Enzyme

【技术实现步骤摘要】
一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法
本专利技术属于珍珠粉
，特别涉及一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法。
技术介绍
珍珠是珍珠贝类和珠母贝类软体动物体内分泌作用而生成的含碳酸钙的矿物珠粒，由大量微小的文石晶体集合而成。珍珠粉既是一种用于装饰的珍宝，又是一种宝贵的中药材和化妆品。我国明朝著名医学家李时珍在《本草纲目》中记载:“珍珠主治：镇心。点目，去肤黯障膜。涂面，令人润泽好颜色；涂手足，去皮肤逆肿。”珍珠粉由无机成分与有机成分结合而成，其中有机成分主要是蛋白质。蛋白质是由肽组成的，而肽又是由氨基酸组成的。氨基酸一共有22种，其中有一部分是含硫氨基酸(SAA)，主要包括肤氨酸、半肌氨酸和蛋氨酸。这些氨基酸对于人体皮肤及皮肤衍生物(指甲、毛发)有着不可或缺的作用。珍珠中的主要蛋白为角蛋白。水解珍珠蛋白可产生小分子活性肽。目前对于珍珠功效成分的开发应用相对停留在较为固定的工艺模式中，利用传统水提、酸提及酶解等方法。如公开号为CN101381400的中国专利文献公开了一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，是取纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取，以高速旋转离心方式取悬浮液，经杂质过滤后，通过离心浓缩滤膜装置的离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物；进一步以硫酸铵沉淀法分离出珍珠蛋白与无法沉淀出的蛋白质，并以SephadexG25凝胶依照蛋白质分子量进行层析，得到三个级分：级分A，级分B，级分C。使化妆品、食品等产业，可以由此获得有效成分被纯化的珍珠蛋白或珍珠肽作最佳利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法，提取出来的小分子活性肽具有高活性和针对性，对酪氨酸酶抑制率高，具有美白功效。本专利技术提供如下技术方案：一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法，包括以下步骤：(1)将珍珠粉加入到酸溶液中进行酸解，收集上清液和第一不溶性蛋白；对第一不溶性蛋白进行水冲泡后离心得到第二上清液和第二不溶性蛋白；合并第一上清液和第二上清液；(2)对合并后的第一上清液和第二上清液进行真空热浓缩析出乳酸钙，过滤后与第二不溶性蛋白混合，匀浆制成匀浆液；(3)使用复合蛋白酶液对匀浆液在弱酸性条件下进行酶解，得到酶解液，所述复合蛋白酶液包括胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液；(4)对酶解液进行脱色和灭菌，制成液体或粉末形态的小分子活性肽。在步骤(1)中，将不溶性蛋白在4℃保存。在步骤(1)中，所述珍珠粉为普通珍珠粉、超细珍珠粉或纳米级珍珠粉。在步骤(1)中，所述酸溶液选自盐酸、醋酸、乳酸或醋酸/醋酸钠溶液。优选的，在步骤(1)中，所述珍珠粉为纳米级珍珠粉，所述酸溶液为乳酸。珍珠粉粒度越细，壳角蛋白(不溶性蛋白)的提取率越高；在相同酸浓度下，以乳酸对壳角蛋白的提取率最高。因此，在上述珍珠粉粒径和酸溶液条件下壳角蛋白的提取率最高。在步骤(1)中，所述上清液包括可溶性蛋白和乳酸钙，不溶性蛋白中夹杂有水溶性蛋白和沉淀的乳酸钙。在步骤(2)中，所述匀浆液包括水溶性蛋白和不溶性蛋白组成的总蛋白。在步骤(2)中，所述匀浆液中总蛋白的浓度为1-3mg/mL。由于珍珠粉粒径和酸的种类不同，可以得到不同浓度匀浆液。在步骤(3)中，所述复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的质量比为0.5-3:8-12:2-6。所述复合蛋白酶液通过分别配制胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液后，再进行混合而得到。其中，胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液分别通过将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或角蛋白酶加入到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中进行配制，再按比例混合得到复合蛋白酶液。优选的，在步骤(3)中，所述复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1-2:10-11:3-4。上述质量比的复合蛋白酶液酶解得到的小分子活性肽对酪氨酸酶的抑制率更高，美白功效更好。优选的，在步骤(3)中，所述复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的总质量为匀浆液中总蛋白的质量的1-3％。在步骤(3)中，所述酶解的温度为45-60℃，酶解的时间为12-24h。在步骤(3)中，所述小分子活性肽的分子量小于1000Da。本专利技术通过复合酶提取小分子活性肽，可以减少酶的用量，提取到的小分子活性肽具有高活性和针对性，对酪氨酸酶抑制率高，具有较好的美白功效。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合实施例对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本专利技术，并不限定本专利技术的保护范围。在本专利技术中，复合蛋白酶液通过分别配制胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液后，再进行混合而得到。其中，胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液分别通过将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或角蛋白酶加入到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中进行配制，再按比例混合得到复合蛋白酶液。其中，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶都通过市场购买获得，生产厂家为国药集团化学试剂有限公司。胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液的浓度为0.5mg/mL、5.0mg/mL和3.0mg/mL，制备方法为：将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或角蛋白酶加入到1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.6))，加热至55℃，待酶完全溶解后，冷却至室温，离心，取上清液，4℃保存，得到胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液或角蛋白酶液。按比例混合三种酶液，得到复合蛋白酶液，4℃保存。对本专利技术制备的小分子活性肽进行以下美白活性验证和抗氧化功效验证：美白活性验证-方法1：利用体外酪氨酸酶抑制法通过分光光度计测定加入美白剂前后溶液在475nm处吸光度来计算美白剂对酪氨酸酶的抑制率，通过熊果苷的阳性对照来评价本专利技术制备的小分子活性肽的美白功效。在样品组、标准对照组和阳性对照组分别投入pH6.8、0.05mol/L缓冲液PBS(NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)、150U/ml酶溶液(0.05NNaH2PO4-Na2HPO4缓冲液溶解)、2％(质量分数)熊果苷溶液、小分子活性肽。于37℃水浴中反应10min后，加入0.3％L-酪氨酸溶液，再于37℃中水浴反应30min，测475nm处吸光度。表1相对熊果苷抑制率测定溶液组成/mL样品对酪氨酸酶活性的抑制强度以相对熊果苷抑制率表示，按(1)式计算：抑制率/％＝(A1－AS)/(A1－AC)·100(1)公式中：A1、AC和As分别为阳性对照、标准对照和样品的吸光度值，抑制率高表明其对酶活性抑制强度高。美白活性验证-方法2：按表2进行小分子活性肽对酪氨酸酶活性抑制率试验。表2美白试验测试溶液组成/mL按表2同时配制4组测试样品液，放入25℃水浴反应3.5h后，转移至3mL的比色皿中，于475nm处测吸光度，按(2)式计算对酪氨酸酶的抑制率：其中，A1为空白组吸光度值；A2为反应体系自身的吸光度值；A3为待测样吸光度值；A4为待测样在反应体系中自身吸光度值。实施例1(1)脱钙：珍珠粉称重，按1g珍珠粉(纳米级珍珠粉)：12mL乳酸(2mol/L)的比例缓慢加入乳酸溶液，边加边搅拌，酸解至无气泡产生，离心，分别收集上清液和不溶性蛋白。纯水冲泡不溶性蛋白并再次离心、倒出上清液、合并上清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将珍珠粉加入到酸溶液中进行酸解，收集上清液和第一不溶性蛋白；对第一不溶性蛋白进行水冲泡后离心得到第二上清液和第二不溶性蛋白；合并第一上清液和第二上清液；(2)对合并后的第一上清液和第二上清液进行真空热浓缩析出乳酸钙，过滤后与第二不溶性蛋白混合，匀浆制成匀浆液；(3)使用复合蛋白酶液对匀浆液在弱酸性条件下进行酶解，得到酶解液，所述复合蛋白酶液包括胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液；(4)对酶解液进行脱色和灭菌，制成液体或粉末形态的小分子活性肽。

【技术特征摘要】
1.一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将珍珠粉加入到酸溶液中进行酸解，收集上清液和第一不溶性蛋白；对第一不溶性蛋白进行水冲泡后离心得到第二上清液和第二不溶性蛋白；合并第一上清液和第二上清液；(2)对合并后的第一上清液和第二上清液进行真空热浓缩析出乳酸钙，过滤后与第二不溶性蛋白混合，匀浆制成匀浆液；(3)使用复合蛋白酶液对匀浆液在弱酸性条件下进行酶解，得到酶解液，所述复合蛋白酶液包括胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液；(4)对酶解液进行脱色和灭菌，制成液体或粉末形态的小分子活性肽。2.根据权利要求1所述的利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述珍珠粉为普通珍珠粉、超细珍珠粉或纳米级珍珠粉。3.根据权利要求1所述的利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述酸溶液选自盐酸、醋酸、乳酸或醋酸/醋酸钠溶液。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮华君，唐长明，何清清，斯广杰，周牡艳，杨桂昌，魏狄兰，王婷，
申请(专利权)人：浙江长生鸟健康科技股份有限公司，浙江科美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33