蛋白质筛选和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种从多肽文库对多肽进行鉴定和定量的方法。所述方法包括如下步骤：1、提供多肽文库和检测标记文库；2、生成嵌套文库，所述嵌套文库包含所述多肽和所述检测标记；3、对所述嵌套文库进行测序；4、在一个或多个独立于物理基因型‑表型连锁的筛选步骤中筛选所述嵌套文库的成员；5、从所筛选的多肽中分离所述检测标记；6、通过质谱分析对所述检测标记进行鉴定和定量；7、获得所筛选的多肽的序列。本发明专利技术还涉及多肽集合、检测标记集合以及质粒载体集合。

Screening and Detection of Proteins

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质筛选和检测方法本专利技术涉及一种将检测标记附着于蛋白质文库和接下来使用所述标记对符合所限定的生物物理学或药理学标准的蛋白质进行鉴定和定量的方法。描述。
技术介绍
蛋白质筛选和蛋白质展示方法是现有技术对表现某些特征（例如，对于靶分子的高亲和力结合）的蛋白质进行鉴定或富集的方法。在筛选中，逐一分析蛋白质。这是非常费力的，并且限于较低数量的试验。例如，在结合蛋白的筛选中，通过ELISA鉴定各结合蛋白候选物，进一步表征阳性ELISA命中，例如，通过尺寸排阻色谱、解折叠实验对其进行生物物理学表征，在动物模型中体内检测其治疗潜能。在展示方法中，经数轮筛选富集整个蛋白质池（源于文库）。对于蛋白质池的处理允许无大量劳动情况下的巨大通量。然而，诸如噬菌体、核糖体或酵母菌展示的展示方法需要表型（蛋白质）和基因型（其编码核酸）之间的物理连锁。因为进行展示（即，噬菌体、核糖体以及编码DNA或RNA）所需的物理实体大小通常是实际结合分子（例如抗体片段）的超过100倍，这对于大多数分析来说是严重的限制。这不可避免地导致筛选偏差，并将可能的筛选压力限制到小亚组的可想象的筛选压力—当前仅不受展示颗粒巨大尺寸严重影响本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从多肽文库筛选多肽的方法，所述方法包括下述步骤：a. 提供第一核酸文库，其中所述第一核酸文库的各成员包含编码第一多肽文库的成员的多肽编码序列；b. 提供第二核酸文库，其中所述第二核酸文库包含多个成员，其中各成员包含编码检测标记的标记编码序列，其中所述检测标记：i. 通过氨基酸序列表征，所述氨基酸序列不同于由所述第二核酸文库编码的任何其他检测标记的氨基酸序列；ii. 通过200 Da和5000 Da之间、特别500 Da和2500 Da之间、更特别约900 Da和2200 Da之间的分子量来表征；以及iii. 包含第一可切割元件；c. 将所述第一核酸文库的所述成员中包含的所述多肽编码序列...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.31 EP 16196571.01.一种从多肽文库筛选多肽的方法，所述方法包括下述步骤：a.提供第一核酸文库，其中所述第一核酸文库的各成员包含编码第一多肽文库的成员的多肽编码序列；b.提供第二核酸文库，其中所述第二核酸文库包含多个成员，其中各成员包含编码检测标记的标记编码序列，其中所述检测标记：i.通过氨基酸序列表征，所述氨基酸序列不同于由所述第二核酸文库编码的任何其他检测标记的氨基酸序列；ii.通过200Da和5000Da之间、特别500Da和2500Da之间、更特别约900Da和2200Da之间的分子量来表征；以及iii.包含第一可切割元件；c.将所述第一核酸文库的所述成员中包含的所述多肽编码序列插入所述第二核酸文库的成员中，由此生成标记核酸文库，所述标记核酸文库编码标记多肽文库，其中所述标记多肽文库的各成员包含多肽和检测标记，所述检测标记与所述多肽通过所述第一可切割元件分离；d.从所述标记核酸文库获得多个核酸序列，其中所述多个核酸序列中的各序列包含多肽编码序列和标记编码序列；e.对于步骤d中获得的标记编码序列所编码的各检测标记预测质谱分析裂解模式；f.从所述标记核酸文库表达所述标记多肽文库；g.在筛选步骤中筛选所述标记多肽文库的成员，产生所筛选的多肽；h.切割所述第一可切割元件，由此，将所述检测标记与所述筛选的多肽分离，产生分离的检测标记；i.以下述方式对所述分离的检测标记进行鉴定：i.通过质谱分析记录所述分离的检测标记的裂解模式；ii.将步骤i中获得的所述裂解模式与步骤e中预测的所述裂解模式匹配，由此鉴定所述分离的检测标记；j.从步骤d中获得的所述多个核酸序列，筛选包含编码步骤i中所鉴定的所述检测标记的标记编码序列的核酸序列，由此鉴定与步骤i中鉴定的所述检测标记缔合的所述标记多肽文库的成员。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离的检测标记通过－27和128之间、特别－1和70之间的疏水性值来表征。3.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述标记多肽文库的所述成员与亲和标记缔合，所述亲和标记特别选自His标记、CBP标记、CYD标记、Strep标记、StrepII标记、FLAG标记、HPC标记、GST标记、Avi标记、生物素化标记、Myc标记、3xFLAG标记以及MBP标记。4.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述检测标记与亲和标记缔合，所述亲和标记特别选自His标记、CBP标记、CYD标记、Strep标记、StrepII标记、FLAG标记、HPC标记、GST标记、Avi标记、生物素化标记、Myc标记、3xFLAG标记以及MBP标记。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述亲和标记与所述检测标记通过第二可切割元件分离，所述第二可切割元件在步骤i前被切割。6.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中步骤i包括通过与电喷雾电离质谱偶联的液相色谱（LC-MC）分析所述分离的检测标记。7.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中步骤d包括以≥5x的覆盖区对所述完整的标记表达文库进行测序。8.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述分离的检测标记由5至30个、特别7至21个、更特别11至15个氨基酸组成，并仅包含一个具有正电荷侧链的氨基酸。9.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述分离的检测标记包含选自序列元件I的集合的序列元件I，其中所述序列元件I由5至10个、特别7个氨基酸组成，各氨基酸彼此独立地选自A、S、T、N、Q、D、E、V、L、I、F、Y、W、G以及P。10.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述一个具有正电荷侧链的氨基酸位于所述分离的检测标记的C末端，特别地，所述一个具有正电荷侧链的氨基酸是C末端精氨酸，所述分离的检测标记中包含的其余氨基酸独立地选自A、S、T、N、Q、D、E、V、L、I、F、Y、W、G以及P。11.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述分离的检测标记包含：a.所述序列元件I，其中所述序列元件I由5至10个、特别7个氨基酸组成，各氨基酸彼此独立地选自A、S、T、N、Q、D、E、V、L、I、F、Y、W、G以及P；和b.序列元件II，所述序列元件II选自SEQIDNO01（WR）、SEQIDNO02（WLR）、SEQIDNO03（WQSR）、SEQIDNO04（WLTVR）以及SEQIDNO05（WQEGGR）。12.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述分离的检测标记由下述组成：a.序列元件III，其中所述序列元件III是GS；b.所述序列元件I，其中所述序列元件I由5至10个、特别7个氨基酸组成，各氨基酸彼此独立地选自A、S、T、N、Q、D、E、V、L、I、F、Y、W、G以及P；和c.所述序列元件II，所述序列元件II选自SEQIDNO01（WR）、SEQIDNO02（WLR）、SEQIDNO03（WQSR）、SEQIDNO04（WLTVR）以及SEQIDNO05（WQEGGR），其中特别地，所述序列元件从N末端至C末端的次序是序列元件III、序列元件I、序列元件II。13.根据上述权利要求9至12任一项所述的方法，其中所述第一核酸文库中包含的所有序列元件I一起组成序列元件I的集合，其中在所述序列元件I的集合中，各氨基酸以表1中指明的频率存在。14.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中所述第一和/或所述第二可切割元件是或包含蛋白酶识别序列。15.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中：a.所述第一可切割元件是或包含凝血酶识别序列；和/或b.所述第二可切割元件是或包含胰蛋白酶识别序列。16.一种多肽集合，其中所述多肽集合的各成员与检测标记、特别至少1种、更特别至少2种、甚至更特别至少5种、甚至更特别至少10种、甚至更特别约20种检测标记缔合，其中所述检测标记：a.通过氨基酸序列来表征，所述氨基酸序列不同于由所述多个表达载体编码的任何其他检测标记的氨基酸序列；b.通过200Da和5000Da之间、特别500Da和2500Da之间、更特别约900Da和2200Da之间的分子量来表征；c.与所述多肽集合的所述成员通过第一可切割元件分离。17.根据权利要求16所述的多肽集合，其中所述分离的检测标记通过－27和128之间、特别－1和70之间的疏水性值来表征。18.根据权利要求16至17任一项所述的多肽集合，其中所述多肽集合的各成员与亲和标记缔合，所述亲和标记特别选自His标记、CBP标记、CYD标记、Strep标记、StrepII标记、FLAG标记、HPC标记、GST标记、Avi标记、生物素化标记、Myc标记、3xFLAG标记以及MBP标记。19.根据权利要求16至18任一项所述的多肽集合，其中所述检测标记与亲和标记缔合，所述亲和标记特别选自His标记、CBP标记、CYD标记、Strep标记、StrepII标记、FLAG标记、HPC标记、GST标记、Avi标记、生物素化标记、Myc标记、3xFLAG标记以及MBP标记，其中所述亲和标记与所述检测标记通过第二可切割元件分离。20.根据权利要求16至19任一项所述的多肽集合，其中所述检测标记由4至20个、特别7至18个、更特别11至15个氨基酸组成，并仅包含一个具有正电荷侧链的氨基酸。21.根据权利要求16至20任一项所述的多肽集合，其中所述检测标记包含：a.序列元件I，其中所述序列元件I由5至10个、特别7个氨基酸组成，各氨基酸彼此独立地选自A、S、T、N、Q、D、E、V、L、I、F、Y、W、G以及P；和b.序列元件II，所述序列元件II选自SEQIDNO01（WR）、SEQIDNO02（WLR）、SEQIDNO03（WQSR）、SEQIDNO04（WLTVR）以及SEQIDNO05（WQEGGR）。22.一种检测标记，所述检测标记由4至20个、特别7至18个、更特别11至15个氨基酸组成，其中所述检测标记：a.仅包含一个具有正电荷侧链的氨基酸；b.通过200Da和5000Da之间、特别500Da和2500Da之间、更特别900Da和2200Da之间的分子量来表征。23.根据权利要求22所述的检测标记，其中所述检测标记基本由下述组成：a.序列元件I，其中所述序列元件I由5至...

【专利技术属性】
技术研发人员：M西格，P埃格洛夫，I兹梅曼，
申请(专利权)人：苏黎世大学，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH