一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种基于共振能量转移的抗体定向固定双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，属于电化学发光检测技术领域。三氧化钼对三联吡啶钌具有良好的猝灭效果，金纳米粒子与三氧化钼成功的复合，进一步增强了三氧化钼对三联吡啶钌的电致化学发光信号的猝灭作用。采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体，实现抗体的定向位点捕获。根据对不同浓度的原降钙素响应的电化学发光信号强度不同，实现对原降钙素的检测。通过采用加标回收法来检测不同浓度的原降钙素在人类血清中的样品回收率，以展示本方法的准确度和精密度，测得回收率的范围为100.3~104.2%，说明该方法准确可靠。

Preparation and application of a double quenching electrochemiluminescence strategy for the detection of procalcitonin

【技术实现步骤摘要】
一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法及应用
本专利技术涉及一种基于金复合的三氧化钼空心纳米球猝灭三联吡啶钌负载中空多片层硫化铟的电致化学发光免疫传感器的制备及应用，具体是采用三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟作为发光材料，金功能化的金复合的三氧化钼空心纳米球作为猝灭剂，并且采用多肽链实现对抗体的定向固定，制备的一种检测原降钙素的猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光检测

技术介绍
SIRS指全身炎症反应即机体对多种细胞因子/炎症介质的反应。内毒素是全身炎症反应SIR的触发因素，目前尚无明显的治疗方法。因此，许多新一代的抗生素，化学疗法或其他先进的医疗手段已被用来试图对它进行阻止。原降钙素作为血清中SIRS的典型生物标志物，对SIRS的早期准确可靠诊断起着至关重要的作用。目前检测原降钙素的分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法和试剂盒法，但是所用的试剂有效期短，具有放射性污染，检测周期长，灵敏度低，步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点，本专利技术设计了一种特异性强、灵敏度高、无放射性污染、操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。同时生物活性的保持对于传感器的灵敏度和可行性具有巨大意义，因此，采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体，实现抗体的定向位点捕获。电化学发光是由电化学反应直接或间接引发的化学发光现象，作为电化学和化学发光互相交叉渗透的产物，该方法既有发光分析的超高灵敏度，又结合了电化学电位可控的优点，所以引起了分析化学和生物分析等诸多领域的高度重视。传统电化学发光材料三联吡啶钌具有在电极表面固定困难、发光信号不稳定等缺点。因此，本专利技术制备了一种中空多片层硫化铟与三联吡啶钌复合作为基底，以金复合的三氧化钼空心纳米球作为猝灭探针，构建了一种双猝灭型的电致化学发光传感器用于原降钙素的检测。上述材料在电化学发光传感器中的相关应用尚属首次。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有传感器的生物活性保护提供一种适合的应对方法，并且针对现有的全身炎症反应综合症的检测方法存在的问题，提供一种基于金复合的三氧化钼空心纳米球猝灭三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的电致化学发光免疫传感器的制备及应用，实现对全身炎症反应综合症的疾病标志物的快速、灵敏、特异、高效检测。本专利技术将中空多片层硫化铟固载三联吡啶钌作为基底，金复合的三氧化钼空心纳米球作为双猝灭剂，制备了一种夹心型电化学发光传感器，用于原降钙素的灵敏检测。本专利技术制备的电化学发光传感器对原降钙素的检测范围为0.1pg/mL~50ng/mL，检测限达12.49pg/mL。该传感器可有效用于原降钙素的分析检测，具有制备简单快速、分析成本低、灵敏度高等优点。本专利技术的技术方案如下：1.一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；（2）在处理好的电极表面滴加6μL、浓度为0.5~5mg/mL的三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料，4°C下晾干成膜；（3）加入3~8mM巯基乙酸在4°C下浸泡5h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30min来活化羧基；（4）继续在4°C条件下浸泡浓度为5~15μg/mL的原降钙素一抗1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；（5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；（6）滴加6μL、浓度为0.0001~50ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；（7）继续滴加6μL、浓度为2~4mg/mL的金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液于电极表面，室温下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干。2.如权利要求1所述的一种一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述基底材料三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备，包括以下步骤：（1）中空多片层硫化铟的制备首先制备前驱体：4~6mg水合硝酸铟和5~8mg1,4-对苯二甲酸酸溶解在2mL的N,N-二甲基甲酰胺，搅拌10min。然后，将混合均匀的溶液在120°C下加热30min，冷却到室温后，所得白色沉淀用乙醇洗三次并干燥。其次，前驱体添加到含有200~500mg的硫脲的40mL乙醇溶液中搅拌2min，混合物转移到一个80mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中在180°C反应3h。冷却到室温后，用乙醇和超纯水对沉淀进行三次清洗并干燥，得到黄色的粉末即为中空多片层硫化铟；（2）三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备称取2~5mg中空多片层硫化铟溶于1mL去离子水配制成2mg/mL溶液，向其中加入1mL、1×10-3mol/L的三联吡啶钌混合，在室温下避光振荡12h，经过离心后重新分散到1mL去离子水中得到三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟，储存在4°C下备用。3.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述金复合的三氧化钼空心纳米球标记的原降钙素检测抗体溶液的制备，包括以下步骤：（1）三氧化钼空心纳米球的制备首先，将0.12~0.18gC10H14MoO6在20~50mL正丁醇中超声溶解10min，使固体均匀分散到溶剂中。然后在磁力搅拌下，将5~10mL1M硝酸添加到混合溶液后持续搅拌1h。将获得混合溶液转移到一个50mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜。之后，在220°C下加热12h，并冷却到室温。用去离子水和无水乙醇依次洗涤黑色沉淀物2~6次。在60°C干燥5h后得到前驱体MoO2，然后在300~550°C空气氛围下加热2~5h。获得的白色MoO3粉末；（2）金复合的三氧化钼空心纳米球的制备1~3mLHAuCl4（1%）和10~15mg聚乙烯吡咯烷酮添加到上述混合溶液中搅拌10h。随后，4mL的柠檬酸钠溶液（50mM）和0.05~0.1mgNaBH4被添加到混合搅拌12h，用超纯水和无水乙醇清洗后所得固体即为金复合的三氧化钼空心纳米球；（3）金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液的制备将1mL50ng/mLHWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4°C振荡1h。12000rpm离心后，将沉淀物分散到1mLpH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后400μL0.1%BSA的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入100~300μL10mg/mL的原降钙素抗原的二抗，在4°C下孵化10~15h；随后离心去除上清液，重新分散到在1~3mLpH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液，储存在4°C下备用。4.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；（3）加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素一抗1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；（5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；（7）继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干。...

【技术特征摘要】
1.一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；（2）在处理好的电极表面滴加6μL、浓度为0.5~5mg/mL的三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料，4°C下晾干成膜；（3）加入3~8mM巯基乙酸在4°C下浸泡5h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30min来活化羧基；（4）继续在4°C条件下浸泡浓度为5~15μg/mL的原降钙素一抗1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；（5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；（6）滴加6μL、浓度为0.0001~50ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；（7）继续滴加6μL、浓度为2~4mg/mL的金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液于电极表面，室温下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干。2.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述基底材料三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备，包括以下步骤：（1）中空多片层硫化铟的制备首先制备前驱体：4~6mg水合硝酸铟和5~8mg1,4-对苯二甲酸酸溶解在2mL的N,N-二甲基甲酰胺，搅拌10min;然后，将混合均匀的溶液在120°C下加热30min，冷却到室温后，所得白色沉淀用乙醇洗三次并干燥;其次，前驱体添加到含有200~500mg的硫脲的40mL乙醇溶液中搅拌2min，混合物转移到一个80mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中在180°C反应3h冷却到室温后，用乙醇和超纯水对沉淀进行三次清洗并干燥，得到黄色的粉末即为中空多片层硫化铟；（2）三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备称取2~5mg中空多片层硫化铟溶于1mL去离子水配制成2mg/mL溶液，向其中加入1mL、1×10-3mol/L的三联吡啶钌混合，在室温下避光振荡12h，经过离心后重新分散到1mL去离子水中得到三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟，储存在4°C下备用。3.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，薛经纬，王欢，吴丹，马洪敏，冯锐，范大伟，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37