一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法，属于电化学发光传感器领域。本发明专利技术以三联吡啶钌功能化的MIL‑101(Al):Ru作为发光体，并以聚乙烯亚胺作为共反应剂，合成了自增强型电化学发光复合物来提高三联吡啶钌ECL信号的强度和稳定性，同时以铜离子功能化四氧化三铁‑聚多巴胺纳米球作为猝灭探针来高效猝灭三联吡啶钌的ECL，实现了在500 fg·mL

Preparation of a Tripyridine Ruthenium Functionalized MOF Electrochemiluminescent Immunosensor for the Detection of Procalcitonin

【技术实现步骤摘要】
一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法
本专利技术涉及一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法。具体是采用自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物作为发光体，以铜离子功能化四氧化三铁-聚多巴胺纳米球作为猝灭剂，制备了一种检测降钙素原的信号猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光传感器领域。
技术介绍
降钙素原（procalcitonin，PCT）是降钙素的前肽物质，是由甲状腺细胞产生的含116个氨基酸的蛋白质，正常人体血液中PCT水平低于0.1ng/mL，而细菌感染患者、败血症患者体内PCT水平相当于正常人的上千倍。降钙素原反映了全身炎症反应的活跃程度，与其他感染指标相比诊断准确性高，目前已经成为诊断细菌感染敏感且特异的指标，用于临床感染性疾病的鉴别诊断。因此，早期、动态监测PCT水平，对明确血流感染、评估抗感染治疗效果及合理使用抗菌药物具有重要的价值。目前检测PCT含量常用的方法有电化学免疫分析、表面等离子共振、酶联免疫分析等。鉴于电化学免疫分析灵敏度低，酶联免疫分析操作繁琐、耗费时间长，表面等离子共振稳定性差、易受干扰等问题，本专利技术提出了一种高灵敏、高选择性的猝灭型电化学发光免疫分析策略用于PCT的检测。电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）结合了电化学电位可控和化学发光高灵敏度的特点，已经发展成为一种极具应用潜力的分析方法。作为常用的电化学发光试剂，三联吡啶钌由于其良好的水溶性，如何将其稳定地修饰在电极表面是使其能更好应用的关键性问题。利用金属有机框架材料（MOF）比表面积大、孔径可调等特点，本专利技术合成了一种三联吡啶钌功能化的MOF（MIL-101(Al):Ru），MIL-101(Al)具有1.2nm和1.6nm两种孔径，能够将三联吡啶钌封装在其内部，从而实现在电极表面大量且稳定地固载三联吡啶钌。自增强型ECL复合物已经广泛地应用于电化学发光信号放大策略中，它将ECL发光体和共反应剂结合到同一纳米结构内，不仅能够缩短电子传递距离、减少能量损失，而且能简化操作步骤、节省操作时间。通过MOF实现三联吡啶钌的大量固载，同时共反应剂聚乙烯亚胺（PEI）与三联吡啶钌形成自增强型发光材料，获得强而稳定的初始ECL信号。而猝灭型传感策略的应用前提是初始ECL信号必须强而稳定，并且猝灭探针应该有高效的猝灭能力。聚多巴胺（PDA）由于生物相容性好、易于功能化和吸附等特点被广泛应用于生物传感和生物医药等领域。在碱性环境下，多巴胺能够发生自聚合反应，在四氧化三铁纳米球表面形成一层PDA壳，而PDA能够通过席夫碱反应或麦克尔加成反应与蛋白质的氨基反应，因此抗体不需要任何活化步骤就能够连接到PDA表面。此外，利用PDA能够吸附污水中重金属离子的特点，对三联吡啶钌有猝灭效果的铜离子能够吸附在PDA表面，从而得到对三联吡啶钌有高效猝灭能力的猝灭探针。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是合成三联吡啶钌功能化的MIL-101(Al)并将其作为ECL发光体。在MIL-101(Al)的合成过程中通过调节反应物的摩尔比和反应温度来控制MOF的形貌，将三联吡啶钌大量地封装在MOF内部，从而得到强而稳定的电化学发光信号。本专利技术的目的之二是以聚乙烯亚胺作为三联吡啶钌的共反应剂，将聚乙烯亚胺和三联吡啶钌共价连接在同一纳米结构内，构建自增强型电化学发光复合物，缩短发光体和共反应剂的电子传输距离，减少能量损失，从而实现发光体ECL信号的放大。本专利技术的目的之三是合成铜离子功能化的四氧化三铁-聚多巴胺复合物作为猝灭探针。包裹在四氧化三铁表面的聚多巴胺由于具有苯醌结构能够猝灭三联吡啶钌的电化学发光信号，同时利用聚多巴胺的吸附特性，将铜离子吸附在聚多巴胺表面，由于激发态电子传递或能量传递，铜离子能够进一步猝灭三联吡啶钌的电化学发光。本专利技术的目的之四是利用猝灭型免疫分析策略，实现对PCT的高效灵敏测定。将具有强而稳定ECL信号的自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物作为传感平台来固定捕获抗体，将具有高效猝灭能力的铜离子功能化的四氧化三铁-聚多巴胺复合物作为猝灭探针来固定检测抗体，以PCT抗原作为目标物，构建信号猝灭型ECL免疫传感器，根据猝灭探针固定在电极表面前后电化学发光信号的变化，实现对PCT浓度的定量分析。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1.本专利技术所述的一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法，所述电化学发光免疫传感器，制备步骤如下：（1）将直径为4mm的玻碳电极用0.05μm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；（2）将4~8µL自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物MIL-101(Al):Ru-PEI-Au水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；（3）继续滴涂6μL、浓度为10μg/mL的降钙素原捕获抗体标准溶液于玻碳电极表面，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（4）继续滴涂3μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，封闭非特异性活性位点，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（5）继续将6μL、浓度为500fg/mL～100ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗体标准溶液滴涂在电极表面，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（6）将5~10μL所制得的铜离子功能化四氧化三铁-聚多巴胺纳米球与降钙素原检测抗体的复合物Fe3O4@PDA-CuxO-Ab2水溶液滴涂到电极表面，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光免疫传感器。2.本专利技术所述的一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法，所述自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物MIL-101(Al):Ru-PEI-Au，制备步骤如下：（1）制备三联吡啶钌功能化MOF将0.1～0.5mmol氧化铝与0.3～0.7mmol2-氨基对苯二甲酸加入到12mLN，N-二甲基甲酰胺中，搅拌均匀后加入0.02~0.06mmol三联吡啶钌，磁力搅拌10分钟后转移至反应釜中，100～150ºC反应72小时，离心后，将沉淀用N，N-二甲基甲酰胺洗涤三次后置于真空干燥箱，60ºC干燥后得到MIL-101(Al):Ru；（2）制备自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物将5mL，5mg/mL的MIL-101(Al):Ru水溶液与1mL含有400mM1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和100mMN-羟基琥珀酰亚胺的水溶液混合来活化MIL-101(Al):Ru的羧基，然后逐滴滴加0.2~1mL质量分数为1%的聚乙烯亚胺PEI水溶液，搅拌4小时，离心后分散到10mL金纳米粒子溶液中，再振荡12小时后得到MIL-101(Al):Ru-PEI-Au。3.本专利技术所述的一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法，所述铜离子功能化四氧化三铁-聚多巴胺纳米球以及降钙素原检测抗体的复合物Fe3O4@PDA-CuxO-Ab2，制备步骤如下：（1）制备四氧化三铁-聚多巴胺纳米球将3～7mmol三氯化铁分散到40mL乙二醇中，然后加入44mmol醋酸钠和1g聚乙二醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，电化学发光免疫传感器的制备包括以下步骤：（1）将直径为4 mm的玻碳电极用0.05 μm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；（2）将4~8 µL自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物MIL‑101(Al):Ru‑PEI‑Au水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；（3）继续滴涂6 μL、浓度为10 μg/mL的降钙素原捕获抗体标准溶液于玻碳电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，封闭非特异性活性位点，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（5）继续将6 μL、浓度为500 fg/mL～100 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗体标准溶液滴涂在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（6）将5~10 μL所制得的铜离子功能化四氧化三铁‑聚多巴胺纳米球与降钙素原检测抗体的复合物Fe3O4@PDA‑CuxO‑Ab2水溶液滴涂到电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光免疫传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，电化学发光免疫传感器的制备包括以下步骤：（1）将直径为4mm的玻碳电极用0.05μm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；（2）将4~8µL自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物MIL-101(Al):Ru-PEI-Au水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；（3）继续滴涂6μL、浓度为10μg/mL的降钙素原捕获抗体标准溶液于玻碳电极表面，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（4）继续滴涂3μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，封闭非特异性活性位点，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（5）继续将6μL、浓度为500fg/mL～100ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗体标准溶液滴涂在电极表面，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；（6）将5~10μL所制得的铜离子功能化四氧化三铁-聚多巴胺纳米球与降钙素原检测抗体的复合物Fe3O4@PDA-CuxO-Ab2水溶液滴涂到电极表面，4ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测降钙素原的电化学发光免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法，所述自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物MIL-101(Al):Ru-PEI-Au，其特征在于，制备步骤如下：（1）制备三联吡啶钌功能化MOF将0.1～0.5mmol氧化铝与0.3～0.7mmol2-氨基对苯二甲酸加入到12mLN，N-二甲基甲酰胺中，搅拌均匀后加入0.02~0.06mmol三联吡啶钌，磁力搅拌10分钟后转移至反应釜中，100～150ºC反应72小时，离心后，将沉淀用N，N-二甲基甲酰胺洗涤三次后置于真空干燥箱，60ºC干燥后得到MIL-101(Al):Ru；（2）制备自增强型三联吡啶钌功能化MOF与金纳米粒子的复合物将5mL，5mg/mL的MIL-101(Al):Ru水溶液与1mL含有400mM1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和100mMN-羟基琥珀酰亚胺的水溶液混合来活化MIL-101(Al):Ru的羧基，然后逐滴滴加0.2~1mL质量分数为1%的聚乙烯亚胺PEI水溶液，搅拌4小时，离心后分散到10mL金纳米粒子溶液中，再振荡12小时后得到MIL-101(Al):Ru-PEI-Au。3.如权利要求1所述的一种三联吡啶钌功能化MOF检测降钙素原的电化学发光免疫传感器...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，王超，鞠熀先，范大伟，匡轩，魏东，张诺，吴丹，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37