【技术实现步骤摘要】
从肿瘤组织检测ALK基因融合变异的方法及其试剂盒
本专利技术涉及数字PCR
,具体涉及一种从肿瘤组织检测ALK基因融合变异的方法及其试剂盒。
技术介绍
间变淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase,ALK)融合基因是非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)中第二常见的驱动基因,在中国NSCLC患者中的突变率为5.3%左右。ALK激酶域共有10个外显子(EXON20-29),最常见的EML4融合发生在EXON20外显子上。目前发现EML4-ALK有30多种融合形式,其他的融合伴侣基因还有KIF5B、TFG、KLC1和PTN3等,目前已报道有30多种。目前ALK基因融合常见的方法主要有荧光原位杂交(FISH)、免疫组化(ICH)、逆转录荧光PCR(RT-PCR)和二代测序(NGS)等方法,这些方法都有不同程度的漏检,有些方法检测流程复杂。除了脑组织之外,ALK基因表达量自出生后下降至低水平,在正常的肺组织中并不表达,其3'端酪氨酸激酶区可与多种伴侣发生融合,使ALK基因的3'端实现了高表达。正是基于ALK基因融合后这一表达特点,本专利技术设计了通过检测ALK基因mRNA的断裂位点之后的3’端表达量与断裂位点之前的5’端表达量的定量差异来检测融合突变。
技术实现思路
为了解决上述关键问题,本专利技术提供一种从肿瘤组织检测ALK基因融合变异的方法,所述方法包括以下步骤:步骤1:从肿瘤组织获得RNA样本;步骤2:在ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域和参照基因mRNA中分 ...
【技术保护点】
1.一种从肿瘤组织检测ALK基因融合变异的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:步骤1:从肿瘤组织获得RNA样本;步骤2:在ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域和参照基因mRNA中分别筛选待测靶标区域;步骤3:对步骤2中筛选的靶标区域分别设计相应的引物对和探针,其中ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端,所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域,使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域;所述ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的的探针和所述参照基因的探针分别用不同的荧光基团进行标记;步骤4:对步骤2中所述筛选的待测靶标区域进行微滴式数字PCR扩增;和步骤5:根据所述ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的和所述参照基因的不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例,来判断肿瘤组织是否存在ALK基因融合变异。
【技术特征摘要】
1.一种从肿瘤组织检测ALK基因融合变异的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:步骤1:从肿瘤组织获得RNA样本;步骤2:在ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域和参照基因mRNA中分别筛选待测靶标区域;步骤3:对步骤2中筛选的靶标区域分别设计相应的引物对和探针,其中ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端,所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域,使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域;所述ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的的探针和所述参照基因的探针分别用不同的荧光基团进行标记;步骤4:对步骤2中所述筛选的待测靶标区域进行微滴式数字PCR扩增;和步骤5:根据所述ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的和所述参照基因的不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例,来判断肿瘤组织是否存在ALK基因融合变异。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3中设计ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物对和探针时,引物和探针的位置可以在20外显子之后的区域;ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端外显子区的引物对和探针时,引物和探针的位置可以在20外显子之前的区域。3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3中设计ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针时,其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子23,下游引物位于ALK基因外显子24,所述探针位于ALK基因外显子23-24拼接区域。4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述ALK基因上游引物为SEQIDNO:1:TCTGAACAGGACGAACTGGA;所述ALK基因下游引物为SEQIDNO:2:TGGTGGTTGAATTTGCTGA;和所述ALK基因探针为SEQIDNO:9:CTCATGGAAGCCC。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3中设计ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针时,其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子24,下游引物位于ALK基因外显子25,所述探针位于ALK基因外显子24-25拼接区域。6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述ALK基因上游引物为SEQIDNO:3:TCAGTATTTGGAGGAAAACCACT;所述ALK基因下游引物为SEQIDNO:4:CCCAGA...
【专利技术属性】
技术研发人员:班贵宏,祝令香,郭永,卢临萍,杨文军,高娜,
申请(专利权)人:新羿制造科技北京有限公司,
类型:发明
国别省市:北京,11
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