本发明专利技术公开一种幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法，其包括(1)向样品中加入第一溶液、于80‑100℃下处理2‑10分钟后，进行第一离心得到第一上清液，其中第一溶液包含1‑10重量％的十二烷基硫酸钠，且pH为5.4‑5.6；(2)向第一上清液中加入抑制剂清除剂混合均匀后，进行第二离心得到第二上清液；(3)向第二上清液中依次加入蛋白酶K和第二溶液并于60‑80℃下孵育5‑20分钟，然后加入无水乙醇混匀得到提取液，其中第二溶液包含30‑50重量％盐酸胍和0.1‑1重量％马来酸，且pH为5.8‑6.2；(4)使用离心柱从提取液中纯化得到核酸；(5)检测核酸中的野生型菌含量和突变型菌含量，由此判断样品中幽门螺旋杆菌的阴阳性以及在阳性情况下幽门螺旋杆菌的克拉霉素耐药性。
Synchronized Detection of Helicobacter Pylori Negative and Positive and Clarithromycin Resistance
【技术实现步骤摘要】
幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种无创高灵敏同时检测幽门螺旋杆菌有无及其克拉霉素耐药性的方法。
技术介绍
幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，简称Hpylori或者Hp)是革兰氏阴性、微需氧的细菌，生存于胃部及十二指肠的各区域内。在人群中具有较高的感染率。随着幽门螺旋杆菌在人群中传播广泛，以及抗生素的广泛应用，Hpylori耐药菌株的发生率逐年上升，根除的难度逐渐增加。最近报道Hpylori耐药是全球性的，其耐药是导致根除治疗失败的主要原因。对Hpylori根除治疗的常用抗生素有克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、四环素及喹诺酮类等，大多数Hpylori菌株对这些抗生素的耐药是由突变引起的，包括自发突变和通过耐药信息的传递引起的突变等。根据中华医学会消化病学会Hp学组2005年对全国16个省市340例Hp耐药情况进行的多中心研究表明，对克拉霉素的耐药率为27.6％，Hpylori对抗生素耐药的检测目前已经不再局限于传统的药物敏感性试验，由传统的细菌培养、药物敏感试验逐渐转向分子生物学检测方法。耐药基因突变的检测若能成为Hpylori检查的常规项目，无论从患者的医药费开支还是药物对患者引起的不良反应方面，均有重要意义。目前临床检测幽门螺旋杆菌主要包括Hp培养，尿素酶实验，Hp糖体ELESA检测和免疫印迹检测法。培养的方法需要1-2周时间，免疫方法不能直接检测菌体，且不能检测是否耐药。幽门螺旋杆菌耐药的检测主要是通过细菌培养进行检测以及基于聚合酶链式反应为基础的分子生物学技术。但是这些方法多依赖于创伤取样，对受检者会造成一定损伤。Hp可从胃经过消化道而随粪便排泄出来，直接检测粪便中HP，难以产生假阴性。因此，粪便已成为公认的检测HP的材料。利用粪便检测HP是一种无创检测手段，病人容易接受。然而，粪便中Hp含量毕竟要低于的胃粘膜组织、胃液中，并且粪便中含有大量复杂成分，很难灵敏地检测。
技术实现思路
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术提供一种幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法，其包括：(1)向样品中加入第一溶液在80-100℃下处理2-10分钟后，进行第一离心得到第一上清液，其中所述第一溶液包含1-10重量％的十二烷基硫酸钠，且pH为5.4-5.6。本专利技术中第一溶液用于裂解细菌细胞。在加入前，优选预热第一溶液至80-100℃，例如85℃，从而避免可能的析出和沉淀。(2)向所述第一上清液中加入抑制剂清除剂混合均匀后，进行第二离心得到第二上清液。在粪便等复杂样品中存在大量抑制因子，常规的核酸纯化方式并不能有效地去此类大量抑制因子而导致后续检测失败。因此，需要在该步骤中加入抑制剂清除剂，以高效地回收复杂样品中的核酸物质。抑制剂清除剂可优选使用PCR抑制剂吸收基质，例如InhibitEX-100。(3)向所述第二上清液中依次加入蛋白酶K和第二溶液并于60-80℃下孵育5-20分钟，然后加入无水乙醇混匀得到提取液，其中所述第二溶液包含30-50重量％盐酸胍和0.1-1重量％马来酸，且pH为5.8-6.2。优选地，蛋白酶K以溶液形式加入，其加入量不特别限定，例如可为10-50μl。蛋白酶K的加入有利于除蛋白和杂质。第二溶液用于进一步裂解细胞。(4)使用离心柱从所述提取液中纯化得到核酸。本专利技术中的离心柱可使用已知产品，在此不作具体限定。(5)检测核酸中的野生型菌含量和突变型菌含量，由此检测样品中幽门螺旋杆菌的阴阳性以及在阳性情况下幽门螺旋杆菌的克拉霉素耐药性。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，所述步骤(5)包括检测幽门螺旋杆菌23SrRNA和16SrRNA的步骤。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，检测幽门螺旋杆菌23SrRNA的步骤包括检测23SrRNA第2142和2143位点突变的步骤。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，在步骤(5)中：当所述野生型菌含量大于2，且所述突变型菌含量大于2时，判定所述样品为幽门螺旋杆菌阳性，且该幽门螺旋杆菌包含耐克拉霉素突变株；当所述野生型菌含量大于2，且所述突变型菌含量为2以下时，判定样品为幽门螺旋杆菌阳性，且该幽门螺旋杆菌不包含耐克拉霉素突变株；当所述野生型菌含量为2以下，且所述突变型菌含量大于2时，判定样品为幽门螺旋杆菌阳性，且该幽门螺旋杆菌均为耐克拉霉素突变株；当所述野生型菌含量为2以下，且所述突变型菌含量为2以下时，判定样品为幽门螺旋杆菌阴性。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，野生型HP菌含量(拷贝/微克粪便DNA)＝((VIC(样品)-VIC(水))×15)/(DNA(样品，μg/μl)×5)突变型HP菌含量(拷贝/微克粪便DNA)＝((FAM(样品)-FAM(水))×15)/(DNA(样品，μg/μl)×5)。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，所述样品为粪便。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，采用基于芯片法的数字PCR进行步骤(5)中的核酸检测。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，所述基于芯片法的数字PCR的反应体系包含2×PCR母液混合物7.5μl、P+P液(23SRNA引物及23SRNA4种探针所配溶液)1.46μl、待检核酸5μl。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，所述基于芯片法的数字PCR的程序如下：第一步：96℃10分钟，一次；第二步：57℃2分钟+98℃30秒，重复44次；第三步：57℃3分钟，一次。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法，所述核酸的浓度大于100ng/μl。本专利技术的优势在于：本专利技术的方法为一种无创的检测方法，可无创、高准确性和高灵敏地检测HP和HP克拉霉素耐药性。优选地，本专利技术的方法基于芯片法的数字PCR(ABI公司)，而不是基于微滴法数字PCR，操作简单，检测耗时短。本专利技术中对幽门螺杆菌23SrRNA第2142或2143位点变异进行同种染料标记，即只要有任一位点突变都表现为突变菌株的存在；而对16S使用不同染料标记，以反应幽门螺杆菌的有无。同一样品中对二者同时检测，从而达到同时检测幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性的目的。另外，本专利技术改变了PCR反应条件，使背景噪声与检测信号能清晰地分离出来。本专利技术的方法优选地通过数字PCR体外扩增法检测粪便样品中的幽门螺旋杆菌23SrRNA基因及其突变，适用于幽门螺旋杆菌感染的辅助诊断数字PCR即DigitalPCR(dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时定量PCR，数字PCR可直接计算出DNA分子的拷贝数，是对起始样品的绝对定量。其灵敏度是普通荧光定量PCR的10倍左右。附图说明图1为示例性数字PCR阴阳性对照扩增图。图2为另一示例性数字PCR阴阳性样本扩增图。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法，其特征在于，包括：(1)向样品中加入第一溶液在80‑100℃下处理2‑10分钟后，进行第一离心得到第一上清液，其中所述第一溶液包含1‑10重量％的十二烷基硫酸钠，且pH为5.4‑5.6；(2)向所述第一上清液中加入抑制剂清除剂混合均匀后，进行第二离心得到第二上清液；(3)向所述第二上清液中依次加入蛋白酶K和第二溶液并于60‑80℃下孵育5‑20分钟，然后加入无水乙醇混匀得到提取液，其中所述第二溶液包含30‑50重量％盐酸胍和0.1‑1重量％马来酸，且pH为5.8‑6.2；(4)使用离心柱从所述提取液中纯化得到核酸；(5)检测核酸中的野生型菌含量和突变型菌含量，由此判断样品中幽门螺旋杆菌的阴阳性以及在阳性情况下幽门螺旋杆菌的克拉霉素耐药性。
【技术特征摘要】
1.一种幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法，其特征在于，包括：(1)向样品中加入第一溶液在80-100℃下处理2-10分钟后，进行第一离心得到第一上清液，其中所述第一溶液包含1-10重量％的十二烷基硫酸钠，且pH为5.4-5.6；(2)向所述第一上清液中加入抑制剂清除剂混合均匀后，进行第二离心得到第二上清液；(3)向所述第二上清液中依次加入蛋白酶K和第二溶液并于60-80℃下孵育5-20分钟，然后加入无水乙醇混匀得到提取液，其中所述第二溶液包含30-50重量％盐酸胍和0.1-1重量％马来酸，且pH为5.8-6.2；(4)使用离心柱从所述提取液中纯化得到核酸；(5)检测核酸中的野生型菌含量和突变型菌含量，由此判断样品中幽门螺旋杆菌的阴阳性以及在阳性情况下幽门螺旋杆菌的克拉霉素耐药性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)包括检测幽门螺旋杆菌的23SrRNA和16SrRNA。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，检测幽门螺旋杆菌23SrRNA的步骤包括检测23SrRNA第2142和2143位点突变的步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中：当所述野生型菌含量大于2，且所述突变型菌含量大于2时，判定所述样品为幽门螺旋杆菌阳性，且该幽门螺旋杆菌包含耐克拉霉素突变株；当所述野生型菌含量大于2，且所述突变型菌含量为2以下时，判定所述样品为幽门螺旋杆菌阳性，...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾旭辉，
申请(专利权)人：深圳前海大井医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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