荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法技术

本发明专利技术公开一种荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法，涉及生物检测技术领域。所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。由该冻干保护剂制备得到的荧光PCR冻干制剂可长期常温保存，且复溶速度快。本发明专利技术还提供一种包括上述冻干保护剂的荧光PCR冻干芯片的制备方法，该方法简单快速，可在八小时内完成冻干步骤。

Freeze-drying protectant of fluorescent PCR reagent and preparation method of freeze-drying chip

【技术实现步骤摘要】
荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法
本专利技术涉及生物检测
更具体地，涉及一种荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法。
技术介绍
1996年美国AppliedBiosystems公司推出了荧光定量PCR扩增技术，PCR扩增时加入荧光染料或荧光标记的特异性的探针，荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，随着PCR的进行，被仪器检测到的荧光信号越来越强，结合软件可以对产物进行分析，根据标准曲线得到待测模板的初始浓度，从而达到定量的目的。该技术操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、应用范围广，被广泛应用于临床诊断、食品安全、法医学等领域。荧光定量PCR扩增反应试剂在保存、运输和使用过程中要求在低温条件下进行，否则诊断试剂容易失效，因此试剂盒的长期保存和长途运输将会受到很大的限制，容易因诊断试剂保存温度不当而使其敏感性下降甚至完全失效，最终导致疫病的检测不及时而造成疫病流行。目前，针对核酸扩增反应试剂缺少能在4℃或室温长期保存的方法。市场上的荧光定量PCR扩增试剂按成份不同，分开保存。常见的三种形式：一是酶一管，Buffer、引物、探针、dNTPs一管；二是酶、Buffer、dNTPs一管，引物探针一管；三是酶一管，引物、探针一管，Buffer、dNTPs一管。采用以上三种方式的原因是，各种组分如果混在一起，长时间会降低反应活性，尤其是在4℃以上条件下，混合后保存不宜超过一天，长期保存需要将各组分分开。现有的荧光定量PCR扩增试剂具有以下不足之处：(1)上述荧光定量PCR扩增试剂需要低温保存，冷链运输，增加了试剂的保存和运输成本；(2)以上三种形式，在使用时需要10-20分钟在4℃化冻，然后按照说明书将各组分挨个混合，操作复杂，容易出错；(3)以上三种形式，需要配备不同量程的移液器，携带不便，不适合现场操作，且以上三种形式，每次混合时均需要更换枪头，浪费耗材；(4)加入模板后需要增加震荡、离心排气的步骤，以使混合均匀，不影响荧光信号采集。冷冻干燥是把试剂预先进行降温冻结成固体，然后在真空条件下升华，将95％以上的水分蒸发掉，而保护剂作为固剂在升华时不会崩塌，保证了冻干制品的形态。整个过程在低温中进行，试剂活性不会受到影响。冻干试剂有着常温稳定、摆脱冷链、即时活化、不相容试剂共存、无交叉污染等很多明显优势，随着产业的升级，越来越多厂家尝试开发冻干试剂。国内对于冻干技术研究的累积相对较少，从学术到人才，都使得冻干技术在实际应用中有较难逾越的壁垒。实际上绝大部分的试剂都可以做成冻干的，他的风险并不是试剂本身，而是错误的方法和巨大的时间成本。现在市场上的冻干制剂一般保存在反应管中，这种用反应管盛放冻干制剂的方法有许多不足之处：(1)由于反应管的结构限制，反应管呈下窄上宽的锥字形，而且反应管需要借助其他工具支撑，反应管试剂与冻干机搁板的接触面积很小，所以升华时传热会受到限制，延长了预冻和升华的时间，反应管中的冻干程序一般在24～30小时，冻干品日产量低；(2)反应管中的冻干，在加入冻干混合试剂后，需要进行离心处理，排出气泡，并将粘附在反应管壁上的试剂离心下来；(3)反应管中的冻干，冻干结束后需要关盖，有两种方式：一种是在冻干机中加装机械臂，冻干结束后自动关盖，这种方法提高了设备成本，另一种方式是冻干结束后将反应管取出，在冻干机外部关盖，这种方法对环境有很高的要求，需要恒温恒湿，湿度不能超过10％，而且在产量较高的情况下，需要增加人力，如果人员不够，关盖速度慢，同一批次干燥制剂与空气接触的时间不同，造成差异，而且如果长时间暴露在空气中，容易吸潮复水；(4)反应管中的冻干制剂对封装有很高的要求，需要干燥剂加真空封装的方法，如果真空泄露，会直接降低冻干制剂的活性，甚至失去活性；(5)反应管中的冻干制品，在运输过程中容易上下移动，冻干粉会粘附在整个反应管内壁上，为了避免损失，实验前需要将反应管离心处理；(6)反应管中的冻干制品呈球形颗粒，复溶速度慢，液滴瞬间加入冻干粉中，容易产生气泡，为了使复溶充分且无气泡，需要进行震荡和离心处理；微流控技术，又称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)，是一种以在微纳米尺度空间中对流体进行操控为主要特征的科学技术，具有将生物、化学等实验室的基本功能诸如样品制备、反应、分离和检测等缩微到一个几平方厘米芯片上的能力，其基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。如何将微流控技术和荧光探针定量技术有效结合，使得荧光定量PCR扩增在医学检测及其他各个领域中的应用前景更加广阔，是一个亟待解决的科学问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种荧光PCR试剂的冻干保护剂及包括其的荧光PCR冻干制剂，由该冻干保护剂制备得到的荧光PCR冻干制剂可长期常温保存，且复溶速度快。本专利技术的另一个目的在于提供一种荧光PCR冻干芯片的制备方法，该方法简单快速，可在八小时内完成冻干步骤。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种荧光PCR试剂的冻干保护剂，所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05g/ml、棉子糖0.12g/ml、右旋糖酐0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。一种荧光PCR冻干制剂，所述冻干制剂由荧光定量PCR试剂和如上所述的冻干保护剂混合均匀后冻干制成。优选地，荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。优选地，所述荧光定量PCR试剂包括荧光定量PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶。一种荧光PCR冻干芯片的制备方法，包括以下步骤：制备冻干保护剂：称取海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油、焦磷酸二乙酯处理过的水，置于容器中混合均匀，加热至完全溶解，放入2～8℃冷却；预混荧光定量PCR试剂：将PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶混合均匀；将预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂混合均匀，制备成冻干试剂；取5～8μL的冻干试剂点在微流控芯片的试剂冻干腔中，将点好冻干试剂的微流控芯片移入冻干机中冻干；冻干结束后，从冻干机中取出冻干芯片并真空封装。优选地，冻干机中的冻干程序为：预冻阶段：-40℃预冻3h±0.5h；主干燥阶段：用时5min抽真空到1mbar，用时20～40min将隔板温度升高至-25℃；解析干燥阶段：真空保持1mbar，用时2h±0.5h将隔板温度升高至30℃；然后抽真空至0.01mbar，保持2h±0.5h。优选地，冻干试剂中，预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。本专利技术的有益效果如下：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光PCR试剂的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。

【技术特征摘要】
1.一种荧光PCR试剂的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。3.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05g/ml、棉子糖0.12g/ml、右旋糖酐0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。4.一种荧光PCR冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂由荧光定量PCR试剂和如权利要求1所述的冻干保护剂混合均匀后冻干制成。5.根据权利要求4所述的冻干制剂，其特征在于，荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。6.根据权利要求4所述的冻干制剂，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂包括荧光定量PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶。7.一种荧光PCR冻干芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备冻干保护剂：称取海藻糖、棉子糖、右...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈娇，刘琦，冯政德，李运涛，周晓光，
申请(专利权)人：融智生物科技青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37