用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法技术

本发明专利技术公开了一种能够提高发酵菌将甾醇转化为粗胆酸的转化率，并且工艺简单的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法。该发酵菌的定向改进方法包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间30d以上；S2、取甾醇倾倒出的土壤；提取菌悬液；将菌悬液滴入到培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；S3、将单菌落在培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；S5、纯菌株接种到新的甾醇培养基上；计算胆酸的转化率；S6、重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率大于或者等于90％。采用该发酵菌的定向改进方法工艺简单，获得的发酵菌转化率高。

Directional Improvement of Fermentation Bacteria for Cholic Acid Production by Sterol Fermentation

【技术实现步骤摘要】
用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法
本专利技术涉及将甾醇发酵生产胆酸的领域，具体涉及一种用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法。
技术介绍
熊去氧胆酸是治疗胆结石疾病的老药，随着熊去氧胆酸需求的增长，以及奥贝胆酸上市，鹅去氧胆酸的需求越来越大，即将出现供不应求的局面，所以需要开发熊去氧胆酸的其它来源。鹅去氧胆酸是从鸡，鸭，猪胆里提取的天然物，主要用于熊去氧胆酸和奥贝胆酸的生产，随着熊去氧胆酸需求的增长，以及奥贝胆酸上市，对鹅去氧胆酸的需求越来越大，即将出现供不应求的局面，所以需要开发其它来源。然而，甾醇可以通过在植物中进行提取，因此来源广泛，便于获得。并且熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸等胆酸可以通过甾醇生物发酵法进行制备。由于现有的甾醇发酵生产胆酸的发酵菌将甾醇发酵生产胆酸率较低，因此需要对发酵菌进行定向改进，从而提高发酵菌的转化率。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提出了一种能够提高发酵菌将甾醇转化为粗胆酸的转化率，并且工艺简单的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现的：用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间30d以上；S2、取甾醇倾倒出的土壤；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌株编号保存；S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率大于或者等于90％。进一步的，在步骤S2中，通过取甾醇倾倒出的土壤；置消毒试管中，加入无菌水以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，从而获得菌悬液。具体的，在步骤S2中通过以下方法获得菌落，将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上，并且放置到恒温培养箱中培养，等到长出菌落后，挑出单菌落。具体的，在步骤S4中通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基放置于试管中，加冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力:若不显蓝紫色，则不具备转化能力。本专利技术所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，其有益效果在于：本专利技术所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法在S1步骤中通过在自然界获得能够将甾醇进行转化，同时可以适应具有甾醇的培养基的菌种。然后通过对菌种进行筛选，筛选出能够将甾醇转化为胆酸的菌株，最后在对菌株进行诱导培养，从而获得高转化率的发酵菌。因此，本专利技术所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，工艺简单，便于实现，同时获得的发酵菌转化率较高。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步详细说明本专利技术。本专利技术所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间60d以上；S2、取甾醇倾倒出的土壤；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌株编号保存；S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率大于或者等于90％。在步骤S1中通过在土壤中连续倾倒甾醇，从而排出土壤中不能适应甾醇环境生长的菌落；最终土壤中留下的均为能够适应甾醇培养基的菌落。在步骤S2中，通过获取土壤中原始的甾醇转化发酵菌，然后对发酵菌进行选取。在步骤S3中，选取纯菌株，并且在S4步骤中对纯菌落中，能够将甾醇转化为胆酸的菌落进行筛选。在步骤S5和S6中对能够将甾醇转化为胆酸的菌落进行诱导培养，从而得到高转化率的发酵菌。具体的，在步骤S2中，通过取甾醇倾倒出的土壤；置消毒试管中，加入无菌水以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，从而获得菌悬液。具体的，在步骤S2中通过以下方法获得菌落，将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上，并且放置到恒温培养箱中培养，等到长出菌落后，挑出单菌落。具体的，在步骤S4中通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基放置于试管中，加冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力:若不显蓝紫色，则不具备转化能力。实施例1用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间65d；S2、取甾醇倾倒出的土壤5g；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；通过取甾醇倾倒出的土壤5g；置消毒试管中，加入无菌水50ml以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，从而获得菌悬液。将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上，并且放置到25℃恒温培养箱中培养，等到长出菌落后，挑出单菌落；所述培养基还包括葡萄糖50g，其中甾醇液1000mL；S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌株编号保存；S4、将50份纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1g放置于试管中，加冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力；若不显蓝紫色，则不具备转化能力。S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率为91％；从而获得发酵菌。实施例2用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间65d；S2、取甾醇倾倒出的土壤5g；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；通过取甾醇倾倒出的土壤5g；置消毒试管中，加入无菌水50ml以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，从而获得菌悬液。将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间60d以上；S2、取甾醇倾倒出的土壤；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌株编号保存；S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率大于或者等于90％。

【技术特征摘要】
1.用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间60d以上；S2、取甾醇倾倒出的土壤；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌株编号保存；S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率大于或者等于90％。2.根据权利要求1所述的用于甾醇发酵生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜琳，张亮富，宋立波，熊丹梅，
申请(专利权)人：成都百代禾诗生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川,51