一种快速高效分析转录因子及其靶DNA结合序列相互作用的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速高效分析转录因子及其靶DNA结合序列相互作用的方法。本发明专利技术采用电泳迁移变化测定(EMSA)或滤膜板测定法这两种测定方法分析连续2倍稀释的细胞裂解物与ECBS‑AFBS探针混合的混合物，发现EMSA能在1:16稀释的细胞裂解物中检测到探针，而滤膜板测定法则可以在1:64稀释的细胞裂解物中检测到探针，这表明滤膜板测定法的灵敏性是EMSA的4倍。因此，滤膜板测定法能够快速有效地分析探针与靶蛋白的结合。

A Fast and Efficient Method for Analyzing the Interaction of Transcription Factor and Target DNA Binding Sequence

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效分析转录因子及其靶DNA结合序列相互作用的方法
：本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种快速高效分析转录因子及其靶DNA结合序列相互作用的方法。
技术介绍
：转录因子(TF)与其靶DNA结合序列之间的相互作用在基因转录调控中至关重要。每个真核TF都可以与染色体DNA上的一组相似DNA序列而非单个DNA序列结合。碱基组成决定了DNA序列对TF的结合亲和性，这可以通过靶序列的比对分析而获知。统计学上简单的位置权重矩阵(PWM)模型通常被用来计算保守的碱基结合序列。在保守序列内，某些碱基对与TF的相互作用是保守的，而其他碱基对则可以更加灵活并且在DNA与TF的相互作用中没有那么重要。与TF相互作用的各个碱基对的贡献由其保守性来评估。此外，保守结合序列还可以通过一些体外方法诸如ChIP-seq或SELEX等由TF特异结合的一组DNA片段或寡核苷酸来确定。然而，目前仍有超过40％的TF未知其靶结合序列。在原核细胞大肠杆菌中，大多数TF都与染色体DNA的单一位点结合，比如砷转录抑制因子(ArsR)。ArsR是一个与其操作子/启动子(O/P)序列结合的金属调控转录抑制因子。然而，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速高效分析转录因子及其靶DNA结合序列相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：制备含有转录因子的细胞裂解物，根据转录因子的靶DNA结合序列设计能与转录因子特异结合的DNA双链探针，所述的DNA双链探针正义链的5’端标记有生物素，将细胞裂解物中的转录因子与DNA双链探针结合，得到蛋白‑探针复合物，将蛋白‑探针复合物结合到硝酸纤维素膜上，洗去游离的DNA双链探针，用SDS处理使结合到硝酸纤维素膜上的蛋白‑探针复合物中的蛋白质变性，释放出结合的DNA双链探针，收集释放的DNA双链探针，将DNA双链探针变性后与预结合在硝酸纤维素膜上的DNA双链探针正义链互补序列进行杂交，依次添加辣根过氧化...

【技术特征摘要】
1.一种快速高效分析转录因子及其靶DNA结合序列相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：制备含有转录因子的细胞裂解物，根据转录因子的靶DNA结合序列设计能与转录因子特异结合的DNA双链探针，所述的DNA双链探针正义链的5’端标记有生物素，将细胞裂解物中的转录因子与DNA双链探针结合，得到蛋白-探针复合物，将蛋白-探针复合物结合到硝酸纤维素膜上，洗去游离的DNA双链探针，用SDS处理使结合到硝酸纤维素膜上的蛋白-探针复合物中的蛋白质变性，释放出结合的DNA双链探针，收集释放的DNA双链探针，将DNA双链探针变性后与预结合在硝酸纤维素膜上的DNA双链探针正义链互补序列进行杂交，依次添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和化学发光底物，记录发光情况，根据发光情况判断转录因子及其靶DNA结合序列的结合强度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：制备含有转录因子的细胞裂解物，根据转录因子的靶DNA结合序列设计能与转录因子特异结合的DNA双链探针，所述的DNA双链探针正义链的5’端标记有生物素，将含有转录因子的细胞裂解物与DNA双链探针形成结合反应体系，在25℃下培养30分钟后，得到蛋白-探针复合物，然后加入到用清洗缓冲液预先清洗的硝酸纤维素膜基的96孔板上，在冰上培养，使蛋白-探针复合物结合到硝酸纤维素膜上，倒置离心，弃去流出液，用清洗缓冲液清洗96孔板，加入洗脱缓冲液使结合到硝酸纤维素膜上的蛋白-探针复合物中的蛋白质变性，释放出结合的DNA双链探针，收集释放的DNA双链探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：李先强，陈杏娟，许玫英，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44