一种外周血单个核细胞改良冻存液制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种外周血单个核细胞改良冻存液，包括以下组分：胎牛血清、右旋糖苷、DMSO、海藻糖、聚乙二醇、重组人白介素‑2。选用胎牛血清及右旋糖苷作为细胞的营养支持组分，保证细胞养分及维持良好的渗透压环境；选用渗透性及非渗透性保护剂DMSO、海藻糖、聚乙二醇三者联合，有效降低细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏成活率；添加重组人白介素‑2，大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性和稳定性。实验结果表明应用本发明专利技术提供的改良冻存液冻存的PBMC细胞复苏后具有较高的PBMC回收率、细胞存活率以及较强的细胞增殖能力及诱导培养成其它免疫细胞的高活性。本发明专利技术提供的冻存液冻存时可直接‑80℃冻存。

A Modified Cryopreservation Solution for Peripheral Blood Mononuclear Cells

【技术实现步骤摘要】
一种外周血单个核细胞改良冻存液
本专利技术属于生物
，具体涉及一种从外周血提取单个核细胞进行冻存时所应用的改良冻存液配方及冻存方法。
技术介绍
外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)，是指外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T\B\NK)，单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其它少量细胞类型。现有技术可将分离的PBMC在不同刺激因子的作用下培养成具有不同生物学功能的效应细胞(例如DC、CIK、NK、CD3AK、γδT等细胞)，不仅在治疗癌症方面有较好的前景，而且从健康养生的角度来看，也可以在患者本人健康时从其外周血中提取免疫细胞，并在以后患者本人出现免疫低下或其他症状时，将存储的免疫细胞进行回输，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。此外，冷冻保存PBMC还可以解决现阶段免疫细胞诱导应用时需要多次采血且采集价格昂贵等问题。因为在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此目前主要应用液氮冷冻保存法来长期保存采集的细胞。正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，需要优化改良冻存液的配方及配制比例，并使冻存操作过程简单方便。而现有细胞冻存液多采用10％的DMSO与90％的胎牛血清，但由于此浓度DMSO仍具有相当的毒性，细胞复苏后如DMSO去除不净会对病人身体不利。而且此种冻存液冻存的细胞存活率以及细胞活性较低。且这种即用型冻存液，需要现配现用，保持期短，批次差异大，保存效果不稳定。在冻存方法上，主要采取缓慢冷冻的方法，即4℃10min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放入液氮中，此操作过程中有时会出现某步骤遗忘(例如放置4℃或-20℃时间过长)从而导致冻存失败。虽然还可以应用程序降温仪冻存，但其使用操作繁琐、成本高，也不易在临床大规模使用。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的就在于提供一种简单有效、安全可靠、细胞复苏活力高的外周血单个核细胞改良冻存液及冻存方法。其特征在于：专利技术的PBMC改良冻存液包括以下组分：胎牛血清、右旋糖苷、DMSO、海藻糖、聚乙二醇(PEG)、重组人白介素-2。本专利技术的另一目的在于提供一种简便的冻存方法，即使用本专利技术提供的冻存液冻存细胞可直接-80℃冻存，不需要采取步骤降温或程序降温，简单方便且效果可靠。优选的，本专利技术所述PBMC改良冻存液包括：胎牛血清20～60体积％；右旋糖苷0.2～0.5g/mL；DMSO0.2～0.7mL/mL、海藻糖0.1～0.4mg/mL、聚乙二醇(PEG)0.1～0.4g/mL、重组人白介素-2200～1000IU/mL。在本专利技术的实施例中，右旋糖酐为低分子量(40KD)右旋糖苷。在本专利技术的实施例中，聚乙二醇(PEG)的分子量为6000。在本专利技术的实施例中，基础培养基为RPMI-1640。作为优选，每10mL细胞冻存液中包括胎牛血清5mL(50体积％)、低分子右旋糖苷0.25g、DMSO1mL、海藻糖10mg、聚乙二醇10mg、重组人白介素-22000IU，余量为基础培养基。作为优选，每10mL细胞冻存液中包括胎牛血清4mL(40体积％)、低分子右旋糖苷0.3g、DMSO0.5mL、海藻糖20mg、聚乙二醇20mg、重组人白介素-24000IU，余量为基础培养基。作为优选，每10mL细胞冻存液中包括胎牛血清2.5mL(25体积％)、低分子右旋糖苷0.4g、DMSO0.5mL、海藻糖30mg、聚乙二醇30mg、重组人白介素-28000IU，余量为基础培养基。胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，能够提供蛋白酶抑制剂，可在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。多数研究者只关注异源动物血清的有害性，从而在冻存过程中将其用其它产品取代，却忽视了其包含的多种因子所发挥的不可替代的作用。本专利技术在不去除胎牛血清的情况下，添加了右旋糖酐，既应用了胎牛血清不可或缺的有益作用，又减少了血清的使用量，从安全性和经济性上都得到了提升。其中，添加的右旋糖酐亦是一种很好的保护剂，能够很好的维持渗透压，即使在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免因温度下降、渗透压改变而出现的细胞死亡现象。二甲基亚砜(DMSO)是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。DMSO在细胞冻存的应用历史中发挥了举足轻重的作用，同样是不可取代的。本专利技术为了规避高浓度DMSO的有害性，添加了聚乙二醇和海藻糖，从而减少了DMSO的使用量。聚乙二醇是一种非渗透性保护剂，可以在冰晶形成之前，优先结合溶液中水分子；降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。海藻糖可以与细胞膜形成玻璃态基质，具有稳定生物膜(细胞膜)和蛋白质结构及抗干燥的作用。三者联合可有效降低冻存液对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏成活率及延长冻存时间。本专利技术还在冻存液中添加了重组人白介素-2(IL-2)，可大幅度提高复苏后培养免疫细胞的活性和稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接规模化扩增问题。本专利技术提供的改良冻存液制备方法为：将右旋糖酐、海藻糖、聚乙二醇和重组人白介素-2依次加入胎牛血清后，加入DMSO，制得细胞冻存液。本专利技术提供的冻存液在冻存人外周血单个核细胞时应用。本专利技术提供的细胞冻存液能够很好的维持人外周血单个核细胞在冻存期间的细胞活性，降低冻存和复苏过程对细胞造成的损伤。实验表明，采用该冻存液冻存人外周血单个核细胞一个月后，细胞复苏后活力可达94.62％，且增殖活力良好。显著优于现有技术。本专利技术还提供人外周血单个核细胞的冻存方法，以本专利技术提供的冻存液冻存人外周血单个核细胞。在本专利技术的实施例中，细胞冻存液于4℃预冷。在本专利技术的实施例中，冻存方法为直接-80℃冻存。在本专利技术的对比例中，应用程序性降温的降温梯度为：a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；b.以5℃/min降至0℃，保持5min；c.以2℃/min降至-10℃，保持5min；d.以l℃/min降至-45℃，保持35min；e.以5℃/min降至-90℃，保持5min；f.结束。在本专利技术的实施例中，人外周血单个核细胞在本专利技术提供的冻存液中的密度为5×107个/mL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1.本专利技术通过添加右旋糖酐，使细胞在温度下降的过程中，维持良好的渗透压环境，减少动物血清的使用，提升安全性，并具有一定的经济效益；2.本专利技术通过添加适量的海藻糖、聚乙二醇可以减少二甲基亚砜的使用量，通过渗透性保护剂及非渗透性保护剂的双重作用，保证细胞在接近冰点时胞内的水分不会结晶，能有效的保护细胞，并有效降低细胞毒性；3.本专利技术通过添加重组人白介素-2能够有效维持细胞的活性，保证细胞复苏后正常的生物学功能。4.本专利技术所述的改良冻存液可直接-80℃冻存，操作简便，摆脱了程序繁琐、操作复杂、容本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血单个核细胞改良冻存液，其特征在于：包括以下组分：胎牛血清、右旋糖苷、DMSO、海藻糖、聚乙二醇(PEG)、重组人白介素‑2。

【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞改良冻存液，其特征在于：包括以下组分：胎牛血清、右旋糖苷、DMSO、海藻糖、聚乙二醇(PEG)、重组人白介素-2。2.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞改良冻存液，其特征在于：包括以下组分：胎牛血清20～60体积％；右旋糖苷0.2～0.5g/mL；DMSO0.2～0.7mL/mL、海藻糖0.1～0.4mg/mL、聚乙二醇(PEG)0.1～0.4g/mL、重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：方艳秋，谭岩，许淑芬，魏海峰，
申请(专利权)人：方艳秋，谭岩，
类型：发明
国别省市：吉林,22