诱变微生物菌株的方法、丁酸梭菌菌株及应用技术

本发明专利技术公开诱变微生物菌株的方法、丁酸梭菌菌株及应用。本发明专利技术通过紫外线结合亚硝酸钠诱变，筛选得出产酸量明显提高的菌株。利用得到的菌株可发酵生产丁酸等酸类物质。另外，还可将这些菌株用于禽类养殖以提高禽类产蛋品质，同时还可应用于酸奶发酵、咀嚼片等的开发利用。

Method of mutagenesis of microbial strains, Clostridium butyricum strains and their application

【技术实现步骤摘要】
诱变微生物菌株的方法、丁酸梭菌菌株及应用
本专利技术涉及丁酸菌菌种育种，具体涉及诱变微生物的菌株及由此得到的丁酸梭菌菌株及其应用。
技术介绍
丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，又称酪酸梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌。丁酸梭菌能够调整肠道菌群平衡，促进肠道益生菌群的增殖，尤其是乳酸菌和双歧杆菌的增殖，而且能够有效防止幽门螺杆菌引起的肠道菌群的异常变化，具有极强的整肠作用。丁酸梭菌也具有抑制肠道内有毒物质，如氨、胺类等的产生，避免此类有害物质在肠道内聚集，减少其对机体的毒害作用，在调整肠道的微生态领域具有重要的应用价值。丁酸梭菌的代谢产物主要是丁酸，人类对短链脂肪酸的吸收和代谢能力很强，其中尤以对丁酸的吸收和代谢为快。丁酸进入肠道后能抑制去乙酰化酶活性、促进结肠蛋白质合成增加，从而促进肠上皮细胞愈合，同时丁酸还能起到调节宿主的基因表达，也能抑制表皮生长因子诱导的细胞增生，并通过下调环氧合酶(Cyclooxygenase)抑制人肠微血管内皮细胞的增生，从而起到了预防和治疗肠炎、肠癌等肠道疾病的作用。鉴于丁酸梭菌优良的生理功能，获得稳定高产丁酸的丁酸梭菌是其发挥效能的关键。菌种的优劣，直接影响到丁酸梭菌产品的产量和质量。优良菌株的选育，是保证丁酸梭菌提高丁酸生产水平的重要环节。但目前的商业性丁酸梭菌普遍存在产酸能力低，特别是丁酸生产水平不足的问题。微生物的育种技术主要有诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。其中，诱变育种能够提高突变率，在较短的时间内活动更多的优良变异类型，产生自然界原来没有的或一般常规方法无法获得的新类型、新性状、新基因，能够打破基因连锁，提高重组率，在水平上，诱变育种往往会导致比同源或异源转基因更大的转变。因此，诱变育种是目前应用最多也是最经济实用的育种方法，是对育种手段不足的一种有益补充。诱变育种可以采用物理方法如紫外诱变，诱变剂主要包括紫外线、X-射线、γ-射线，快速中子等，在诱变微生物菌种中较为常用。也可以采用化学诱变。化学诱变是通过一定浓度范围的化学诱变剂对活体进行处理造成生物细胞内的损伤和错误修复等，产生突变体，具备易操作，剂量易控制，对基因组损伤小，突变率高。由于物理和化学的诱变方法所产生的突变是随机的尽管基因突变频率较高，但突变无方向性，并不能确保增加正向突变的频率，所以选择合适的筛选方法也是保证菌株选育的重要措施。
技术实现思路
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术通过紫外线结合亚硝酸钠诱变，筛选得到产酸量明显提高的菌株。至少部分地基于此完成了本专利技术。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种诱变微生物菌株的方法，其包括以下步骤：(1)使微生物经紫外线照射处理得到第一诱变微生物；和(2)使所述第一诱变微生物与亚硝酸钠接触得到第二诱变微生物。步骤(2)中的亚硝酸钠接触过程可进行一次，也可进行两次以上。下面说明两个步骤。本专利技术的步骤(1)可优选包括下述子步骤：(1-1)培养基的配制：本专利技术的培养基包括生长培养基和筛选培养基。生长培养基用于使微生物在其中生长，包括在生长培养上经紫外线照射处理。生长培养基一般包含葡萄糖、酵母粉、氯化钠、硫酸镁，其pH6-7。生长培养基中，葡萄糖的含量一般为2-20g/L，优选3-15g/L，更优选5-10g/L。酵母粉的含量一般为酵母粉0.5-25g/L，优选1-20g/L，更优选5-15g/L。氯化钠的含量一般为0.05-10g/L，优选0.1-5g/L，更优选0.5-3g/L。硫酸镁的含量一般为0.01-0.1g/L，优选0.02-0.08g/L，更优选0.05-0.06g/L。本专利技术的筛选培养基为在生长培养基的基础上进行加筛选试剂得到的培养基。筛选试剂的实例包括碳酸钙和溴甲酚紫等。碳酸钙的添加量一般为0.5-1wt％。溴甲酚紫的添加量一般为0.02-0.05wt％。筛选培养基的初始pH6-7.0。(1-2)菌悬液的制备：挑取原微生物菌株，接入生长培养基中，活化，37℃静止培养，取对数生长期的种子液进行诱变。将种子液在5000rpm的条件下离心5min，弃上清液，沉淀用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，菌体经玻璃珠打散，制成1-9×107cfu/mL左右的菌悬液。(1-3)紫外线诱变：步骤(1-2)中得到的菌悬液取3mL，倒入带盖的培养皿中，紫外灯照射5-60min后，避光稀释，取一定的稀释倍数涂平板，箱中，37℃厌氧培养24h，所得菌株备用。(1-4)紫外线诱变初筛：以步骤(1-3)诱变菌株的产酸圈和菌体直径(L/D)的比例大小来表示菌株产酸量的多少，以此为指标，选择变色圈和菌落直径比例大的菌落，筛选出表现良好的菌株，进行下一步的复筛。(1-5)紫外线诱变复筛：将(1-4)所得初筛挑选的阳性诱变菌株分别接到液体培养基中，37℃厌氧培养48h，离心取发酵液，用氢氧化钠滴定法测定其产酸总量，以消耗的氢氧化钠摩尔数代表产酸量，并在培养的过程中观测气泡产生的时间以衡量菌体生长的速度，以产酸量及生长快慢为筛选菌株的综合衡量指标。本专利技术的步骤(2)可优选包括以下子步骤：(2-1)亚硝酸钠诱变：取(1-5)中得到阳性菌株，按照(1-2)的方法制备好菌悬液，加入等体积的0.1-1.0mol/L的亚硝酸钠，26℃分别处理5-60min后，加入0.07mol/L的磷酸二氢钠(pH＝8.6)终止反应。一定稀释倍数的诱变菌转接到固体培养基，37℃厌氧培养24h，测定诱变菌株的产酸能力(L/D)。(2-2)亚硝酸钠诱变复筛：对(2-1)选出的阳性诱变菌株进行复筛，通过最先产气泡的时间衡量生长速度较快，通过酸碱滴定法衡量产酸量，筛选生长速度快且产酸量高的菌株。(2-3)亚硝酸钠二次诱变：对(2-2)得菌株进行二次亚硝酸钠诱变，用酸碱滴定法测定产酸能力，筛选出优良的阳性诱变菌株。本专利技术中的微生物的类型不限定，优选微生物为丁酸梭菌。本专利技术的诱变微生物的方法中，步骤(1)得到的第一诱变微生物具有提高的产酸能力。与原野生菌株相比，第一诱变微生物的产酸能力优选提高15％以上。步骤(2)得到的第二诱变微生物具有进一步提高的产酸能力。与原野生菌株相比，第二诱变微生物的产酸能力优选提高提高1.6倍。本专利技术的第二方面，提供由第一方面的诱变微生物菌株的方法得到的诱变菌株。本专利技术的第三方面，提供一种丁酸梭菌，其具有提高的产酸能力。当将所述菌株接到液体培养基中，在37℃厌氧培养48h后，发酵液浓度达到1×108cfu/ml，利用氢氧化钠滴定法测定其产酸量为25mmol/L以上。在某些实施方案中，本专利技术的丁酸梭菌菌株为经本专利技术的诱变方法得到的一种微生物，其已于2019年3月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO：17327。本专利技术的第四方面，提供一种发酵方法，其包括使本专利技术的菌株在适于微生物生长的条件下进行培养得到发酵物的步骤。可选地，本专利技术的发酵方法进一步包括从发酵物中分离丁酸的步骤。本专利技术的第五方面，提供第三方面的菌株的应用。所述应用包括在禽类养殖中的应用，优选地，所述应用包括用于提高禽类产蛋品质；在制备酸奶中的应用，优选地，所述应用包括用于提高酸奶细腻醇厚品质；在制备咀嚼片中的应用，优选地，所述应用包括使所述咀嚼片能够调整本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱变微生物菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使微生物经紫外线照射处理得到第一诱变微生物；和(2)使所述第一诱变微生物与亚硝酸钠接触得到第二诱变微生物。

【技术特征摘要】
1.一种诱变微生物菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使微生物经紫外线照射处理得到第一诱变微生物；和(2)使所述第一诱变微生物与亚硝酸钠接触得到第二诱变微生物。2.根据权利要求1所述的诱变微生物菌株的方法，其特征在于，所述微生物为丁酸梭菌。3.根据权利要求2所述的诱变微生物菌株的方法，其特征在于，所述第一诱变微生物和第二诱变微生物具有提高的产酸能力。4.一种由根据权利要求1-3任一项所述的诱变微生物菌株的方法得到的诱变菌株。5.一种产酸能力提高的丁酸梭菌菌株，其特征在于，当将所述菌株接到液体培养基中，在37℃厌氧培养48h后，发酵液浓度达到1×108cfu/ml，利用氢氧化钠滴定法测定其产酸量为25mmol/L以上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李拖平，韩雪冬，黄昕，李苏红，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21