一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其获得的菌株和应用技术

本发明专利技术涉及一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其获得的菌株和应用，涉及螺旋藻的选育与筛选技术领域。本发明专利技术是利用超声波将螺旋藻破碎成单细胞或二细胞，然后在紫外诱变的条件下使之发生突变，得到耐受高浓度亚硒酸钠的螺旋藻突变株。本发明专利技术采用计数法来计算致死率，相比传统的固体平板涂布法，该方法操作简单、周期短。所得到的富硒螺旋藻突变株对硒的富集能力强，在补硒工业上有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其获得的菌株和应用
本专利技术涉及螺旋藻的选育与筛选
，具体涉及一种富硒螺旋藻的制备方法，更具体地说，本专利技术涉及一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其获得的菌株和应用。
技术介绍
硒是人体必需的微量元素，位于多种抗氧化酶的活性中心，具有重要的生理功能和广泛的药理作用。螺旋藻工业化生产技术成熟，对无机硒有较强的耐受性，是对硒进行生物有机化的理想载体，因此获得拥有高富硒能力的螺旋藻对于我国的补硒工业具有十分重要的意义。硒在人体中主要以硒蛋白形式发挥功能，如维持机体氧化还原平衡、提高免疫力、解除重金属毒性等。我国硒资源分布呈现三个鲜明特点：一是硒资源储备量巨大，总储备量占全球30％以上；二是硒资源分布极为不均，约70％的国土面积属于缺硒地区；三是缺硒人口数量庞大，占全国人口的72％。硒与人体健康密切相关，缺硒会导致克山病、大骨节病的发生。心血管疾病、糖尿病、癌症等疾病也常与缺硒相伴发生。因此合理利用硒资源以解决我国的严重缺硒现状，是当前国家亟需解决的重大问题之一。环境中的硒多为无机硒，无机硒毒性高、人体利用率差，相对而言有机硒是安全有效的补硒形式，有机硒是指硒与蛋白质、糖类和脂质结合成的有机化合物。微藻是地球上的初级生长者，能通过光合作用将二氧化碳和水转化成有机物，螺旋藻是目前能大规模养殖的微藻之一，其生长周期短、生长速度快、硒蛋白丰富。CN1085951公开了一种螺旋藻富硒技术，首先在低硒浓度的培养液中驯化培养，筛选出适应此种培养液的藻体，然后置于高硒浓度培养液中进行高富硒藻种的筛选，筛选出的藻株在相同硒浓度下进行连续培养，或将选出的藻株置于硒浓度为700-1000ppm培养液中，培养时间2-24h进行浓缩培养，得到富硒藻泥用清水将多余的无机硒洗掉，洗涤到PH＝7，在温度为60-80℃下烘干或喷雾干燥成为富硒藻粉。但这种方法将浓缩后的螺旋藻置于超高硒浓度(700-1000ppm)培养液中，让其在短时间(2-24h)内快速富硒。首先，700-1000ppm的硒浓度工作液，硒含量非常高，对正常的螺旋藻来说是有毒的，其次，螺旋藻将硒吸收体内并完成生物转化是一个漫长的生物学过程，难于在2h内完成，因此该专利技术将螺旋藻置于有毒的硒环境中短时间搅拌就制成高富硒藻粉，其富硒效果有待证实。CN101715986A公开了一种富硒红球藻粉的制备方法及应用，其步骤：A、筛选无机硒耐受性强、硒蛋白和虾青素含量高、生长快速的雨生红球藻新品系；B、在一定温度、pH值、光照下，利用红球藻培养基进行培养；C、根据雨生红球藻品种对硒耐受性的不同，采用接种培养基中直接加无机硒或当藻细胞达到一定生物量后加入不同量的无机硒，配制高浓度含硒培养基或低浓度含硒培养基；D、藻细胞连续培养后，通过过滤或离心的方法采收，并用清水冲洗新鲜藻泥，洗去藻细胞表面的无机硒。烘干、喷雾干燥或冷冻干燥获得富硒雨生红球藻藻粉。制备的富硒雨生红球藻藻粉硒化合物含量介于10-2000μg/g，有机硒含量达到99％以上。富硒红球藻制品可在制备食品、保健食品和药品中应用。但该专利技术采用的雨生红球藻是单细胞真核生物，其生长条件要求更苛刻，需要在无菌条件下培养，因此产量很低，大多数企业用该藻种产虾青素；而螺旋藻是多细胞的原核生物，生长速度非常快，可在室外大规模培养。基于上述理由，提出本申请。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其获得的菌株和应用。本专利技术通过人工驯化和紫外诱变的方法筛选到1株高富硒的螺旋藻，能高效的将无机硒转化成有机硒，这对我过补硒工业的发展具有十分重要的意义。为达到本专利技术上述一个目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法，所述方法包括如下步骤：(1)取钝顶螺旋藻，先在低浓度亚硒酸钠的培养基中培养，再依次转接到浓度依次递增的高浓度亚硒酸钠的培养基中，直至得到耐受470mg/L亚硒酸钠的钝顶螺旋藻；(2)将步骤(1)所得耐受470mg/L亚硒酸钠的钝顶螺旋藻超声破碎成单细胞、二细胞或三细胞的藻液；(3)将步骤(2)所得藻液离心后收集沉淀，并用培养基将沉淀稀释；(4)将步骤(3)稀释后的藻液装于平板表面，用紫外光照射至致死率＞90％，然后转移至黑暗条件下，过夜；(5)收集步骤(4)过夜后的藻液、离心、将所得沉淀转移至高亚硒酸钠浓度的培养基中培养，存活下来的细胞即为富硒螺旋藻突变株(藻种)。进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述低浓度亚硒酸钠培养液的浓度为280～360mg/L。进一步地，上述技术方案，步骤(2)所述超声破碎功率为5～30W，优选为20W；超声破碎时间为20～80s，优选为20s。进一步地，上述技术方案，步骤(4)所述紫外光照射时间为20～60s，优选为40s。进一步地，上述技术方案，步骤(4)所述致死率优选采用显微计数法统计。进一步地，上述技术方案，步骤(5)所述高浓度亚硒酸钠培养液的浓度为600～1500mg/L。本专利技术的第二个目的在于提供上述所述利用紫外诱变方法筛选出的富硒螺旋藻突变株。本专利技术的第三个目的在于提供上述所述利用紫外诱变方法筛选出的富硒螺旋藻突变株的应用，可用于制备富硒螺旋藻粉。一种富硒螺旋藻粉，采用如下方法制备而成：将富硒螺旋藻突变株在28℃、PH＝10、光照强度为40μE·M-2·S-1条件下，利用Zarrouk培养基进行培养；在培养初期加入1000mg/L的Na2SeO3，培养2周，离心收集，冷冻真空干燥，制得所述富硒螺旋藻粉。进一步地，上述技术方案，所述Zarrouk培养基主要成分包括：13.61g/LNaHCO3，4.03g/LNa2CO3，0.5g/LK2HPO4，1g/LK2SO4，1g/LNaCl，0.2g/LMgSO4·7H2O，2.5g/LNaNO3，0.04g/LCaCl2·2H2O，0.01g/LFeSO4·7H2O，1ml/L微量元素A5溶液。与现有技术相比，本专利技术涉及的一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法及其应用具有如下有益效果：(1)本专利技术利用超声波将螺旋藻破碎成单细胞或二细胞，然后在紫外诱变的条件下使之发生突变，得到耐受高浓度亚硒酸钠的螺旋藻突变株。本专利技术采用计数法来计算致死率，相比传统的固体平板涂布法，该方法操作简单、周期短。所得到的富硒螺旋藻突变株对硒的富集能力强，在补硒工业上有较大的应用前景。(2)紫外诱变正常实施的一个主要因素是要保证致死率在合适的范围之内，致死率太低则达不到突变效果，致死率太高则能存活的细胞数太少。螺旋藻是多细胞串联的生物，目前的文献中没有关于如何计算螺旋藻致死率的报道。本专利技术通过将多细胞的螺旋藻破碎成单细胞和二细胞的，用显微计数的方法统计数螺旋藻的致死率，为紫外诱变的正常实施提供基础。附图说明图1为本专利技术实施例1～16不同条件超声破碎后的螺旋藻的显微镜照片；图2为本专利技术实施例1～16不同条件超声破碎后的螺旋藻的OD值对比图；图3为本专利技术实施例20中分别采用叶绿素法、OD值法、显微计数法致死率计算结果对比图。具体实施方式下面结合实施案例和附图对本专利技术作进一步详细说明。本实施案例在以本专利技术技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)取钝顶螺旋藻，先在低浓度亚硒酸钠的培养基中培养，再依次转接到浓度依次递增的高浓度亚硒酸钠的培养基中，直至得到耐受470mg/L亚硒酸钠的钝顶螺旋藻；(2)将步骤(1)所得耐受470mg/L亚硒酸钠的钝顶螺旋藻超声破碎成单细胞、二细胞或三细胞的藻液；(3)将步骤(2)所得藻液离心后收集沉淀，并用培养基将沉淀稀释；(4)将步骤(3)稀释后的藻液装于平板表面，用紫外光照射至致死率＞90％，然后转移至黑暗条件下，过夜；(5)收集步骤(4)过夜后的藻液、离心、将所得沉淀转移至高亚硒酸钠浓度的培养基中培养，存活下来的细胞即为富硒螺旋藻突变株。

【技术特征摘要】
1.一种利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)取钝顶螺旋藻，先在低浓度亚硒酸钠的培养基中培养，再依次转接到浓度依次递增的高浓度亚硒酸钠的培养基中，直至得到耐受470mg/L亚硒酸钠的钝顶螺旋藻；(2)将步骤(1)所得耐受470mg/L亚硒酸钠的钝顶螺旋藻超声破碎成单细胞、二细胞或三细胞的藻液；(3)将步骤(2)所得藻液离心后收集沉淀，并用培养基将沉淀稀释；(4)将步骤(3)稀释后的藻液装于平板表面，用紫外光照射至致死率＞90％，然后转移至黑暗条件下，过夜；(5)收集步骤(4)过夜后的藻液、离心、将所得沉淀转移至高亚硒酸钠浓度的培养基中培养，存活下来的细胞即为富硒螺旋藻突变株。2.根据权利要求1所述利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法，其特征在于：步骤(1)所述低浓度亚硒酸钠培养液的浓度为280～360mg/L，步骤(5)所述高浓度亚硒酸钠培养液的浓度为600～1500mg/L。3.根据权利要求1所述利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法，其特征在于：步骤(2)所述超声破碎功率为5～30W；超声破碎时间为20～80s。4.根据权利要求3所述利用紫外诱变筛选富硒螺旋藻突变株的方法，其特征在于：步骤(2)所述超声破碎功率优选为20W；超声破碎时间优选为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宝龙，郑国清，黄开耀，
申请(专利权)人：恩施藻缘硒肽生物科技有限公司，中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42