大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1编码基因的应用制造技术

本发明专利技术公开了大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1编码基因的应用。SEQ ID NO.1所示大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1的编码基因在基因工程改良大豆营养品质中的应用。过表达该基因，能够显著提高大豆含硫氨基酸的含量。本发明专利技术所述的大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1可通过基因工程转化到大豆毛状根中，并最终正调控大豆的含硫氨基酸含量。

Application of GmSET1 Coding Gene of Soybean Sulfite Export Protein

【技术实现步骤摘要】
大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1编码基因的应用
本专利技术涉及大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1编码基因的应用，属于基因工程领域。
技术介绍
大豆蛋白质含量丰富属高蛋白豆类植物，一般豆类蛋白质含量约为20％-30％，碳水化合物占60％左右，而大豆的蛋白含量达到40％左右，其他物质如碳水化合物约占26％，油脂占20％，矿物质占4％，磷脂占2％，并且其还富含丰水溶性和脂溶性维生素，对人类饮食和畜禽饲料来说营养价值极高。相比于玉米、小麦和菜豆等作物，大豆含硫氨基酸含量相对较高，平均为2.4％，但是与3.5％的标准氨基酸比例(由联合国粮食及农业组织FAO规定)相比，还是比较低的。其中Met的含量相对更低，只有1.1-1.6％，成为大豆营养品质的第一限制性氨基酸。因此高大豆营养品质和蛋白利用率的关键是增加大豆籽粒含硫氨基酸的相对含量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1的大豆营养型改良基因工程应用，该基因可作为目的基因导入大豆毛状根中，GmSET1通过增加大豆中甲硫氨酸及半胱氨酸的含量来显著提高其总含硫氨酸的含量。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：SEQIDNO.1所示大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1的编码基因在基因工程改造大豆含硫氨基酸含量中的应用。本专利技术所述的应用,优选过表达该基因，能够显著提高大豆含硫氨基酸的含量。有益效果本专利技术通过实验发现过表达GmSET1的大豆阳性毛状根中基因的转录水平和含硫氨基酸含量都得到了显著提高。与对照相比，GmSET1的相对表达量最高达到其3.43倍，Met含量最大提高了35.6％，且总含硫氨基酸含量最大提高了22.7％。因此判断GmSET1对大豆含硫氨基酸的合成有促进作用，这对大豆营养品质的改良有重要意义。附图说明图1.GmSET1的PCR扩增结果。M为Marker(DL2000，Takara)；1、2、3为GmSET1的目的条带图2.GmSET1在大豆各组织中的转录水平。以科丰材料的根、茎、叶、花、15天和45天的荚皮及种子的cDNA为模板，使用荧光定量QRT-PCR的方法验证GmSET1在植物不同组织中的表达模式。Root：根；Stem：茎；Leaf：叶；Flower：花；15dPod:开花后15天荚皮；45dPod：开花后45天荚皮；15dSeed：开花后15天种子；45dSeed：开花后45天种子图3.GmSET1在四份极端材料中的表达量。测定了GmSET1在2份高含硫氨基酸材料及份低含硫氨基酸材料中的表达情况，以验证其转录水平与大豆含硫氨基酸的关系。NJAU_C097：新昌六月豆；NJAU_C179：鄂豆7号；NJAU_C097和NJAU_C179为高含硫氨基酸材料；NJAU_C129：柘城紫花糙；NJAU_C201：长垣范屯小天鹅蛋，NJAU_C129和NJAU_C201为低含硫氨基酸材料。图4.大豆毛状根的阳性检测。M：DL2000；N,negativecontrol图5.大豆毛状根中过表达GmSET1基因的转录水平。提取PCR检测为阳性的大豆毛状根总RNA进行qRT-PCR，检测目的基因GmSET1在对照和过表达毛状根中的转录水平。图6.过表达GmSET1大豆毛状根中含硫氨基酸含量。测定了转化为阳性的毛状根游离含硫氨基酸含量，以验证过表达GmSET1对大豆含硫氨基酸含量产生的影响。Cys：半胱氨酸；Met：甲硫氨酸；SAA：总含硫氨基酸具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术做进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。实施例1以大豆品种科丰1号为取材对象，取其叶，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(TotalRNAKit，天根，北京，中国)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照日本TaKaRa公司提供的反转录试剂盒(TaKaRaPrimerScriptTMRTreagentkit，日本)的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温，获得科丰1号的cDNA。从NCBI数据库和Phytozomev12大豆数据库，找到GmSET1所对应的基因(Glyma.10g07420，GeneID:100788770)，根据数据库提供的核苷酸序列设计特异引物引物，引物序列见SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，从大豆品种科丰1号的基因编码区(CDS)序列扩增基因，PCR克隆后随后进行PCR产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序，测序后获得具有完整编码区的长度为1395bp的大豆GmSET1基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQIDNO.1，大小为1395bp(图1)，核苷酸序列和氨基酸序列(SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)。2)GmCDF1在科丰1号材料中的组织表达分析在科丰1号材料出苗4周时取根、茎、叶，开花时取花，开花后分别取其15天和45天的荚和种子于液氮中速冻，后储存于-80℃冰箱保存，总RNA的提取同步骤1)。以科丰材料各组织取样获得的总RNA为模板，反转为cDNA。GmSET1荧光定量引物序列见SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，检测GmSET1基因受盐胁迫的表达量变化以大豆组成内参基因Tubulin作为内部参照，引物序列见SEQIDNO.7和SEQIDNO.8，进行实时荧光定量PCR反应(Real-timeRT-PCR)。以科丰材料的根、茎、叶、花、15天和45天的荚皮及种子的cDNA为模板，使用荧光定量QRT-PCR的方法验证GmSET1在植物不同组织中的表达模式。结果表明，GmSET1在根中表达量较高，其次是15天的荚皮、叶和花，在其他组织中的表达量较低(图2)。实施例2基因GmSET1的基因工程应用1)大豆亚硫酸盐输出蛋白编码基因GmSET1的克隆以大豆品种科丰1号根的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，引物序列见SEQIDNO.9和SEQIDNO.10，PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃恒温，测序后获得具有完整编码区的长度为1395bp的大豆GmSET1基因的CDS序列,其序列见SEQIDNO.1；2)植物表达载体的构建构建过表达载体时，将GmSET1基因序列与Vazyme公司的EntryOneStepCloningKit(C114-01)试剂盒中的CEEntryVector载体进行BP反应，并进行菌液PCR测序验证，引物序列见SEQIDNO.9和SEQIDNO.10，具体的PCR过程与步骤1)相同，获得入门载体。接着将得到的入门载体与Vazyme公司开发的EntryOneStepCloningKit(C112-01)进行同源重组，得到pMDC83-GmSET1植物过量表达表达载体，植物转化载体pMDC83含有2x35S强启动子，可强烈诱导目的基因GmSET1在受体中的表达。然本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SEQ ID NO.1所示大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1的编码基因在基因工程改造大豆含硫氨基酸含量中的应用。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.1所示大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1的编码基因在基因工程改造大豆含硫氨基酸含...

【专利技术属性】
技术研发人员：阚贵珍，马玮域，黄方，喻德跃，元文杰，张姗姗，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32