SAA1和或SAA2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用制造技术

本发明专利技术属于医学分子生物学技术领域，公开了SAA1和或SAA2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后检测，SAA CNVs(copy number variations,CNVs)与慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化的显著相关性，并且评估了其成为乙肝后肝硬化生物标志物的可能性。本发明专利技术基于SAA CNVs与慢性乙型肝炎及乙肝后肝硬化的相关性，建立了SAA基因拷贝数变异的检测方法，首次提出SAA CNVs在乙肝后肝硬化的发病、诊断和干预中的临床价值及应用。本发明专利技术通过对SAACNVs的研究，提出SAA基因拷贝数变异是乙肝后肝硬化危险因子，在慢性乙肝及乙肝后肝硬化的预后监测及诊断中具有重要价值和重大临床意义，对于实现肝硬化早期诊断、预后转归，指导治疗等奠定了坚实基础。

Application of SAA1 and or SAA2 gene copy number variation in prognosis monitoring and diagnosis of chronic hepatitis B and post-hepatitis B cirrhosis

【技术实现步骤摘要】
SAA1和或SAA2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用
本专利技术属于医学分子生物学
，涉及SAA1和或SAA2基因拷贝数变异在慢性乙肝及乙肝后肝硬化预后监测及诊断中的应用。
技术介绍
肝硬化(Cirrhosis)是临床常见的慢性进行性疾病，是肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程，由一种或多种病因长期或反复作用而形成的弥漫性肝损害。早在2002年，WHO统计数据即显示全球每年死于肝硬化的人数近8万例。至2010年，肝硬化已经是公认的导致人类死亡的前10大疾病。因此，肝硬化已成为全球性的公共健康问题，发病率之高，危害之重，不容忽视。在中国导致肝硬化最常见的病因为乙肝(HBV)感染，世界人口总数的约1/3(20亿)感染过或正在感染乙肝病毒，其中有3.5亿人为终身感染者。而我国的HBV感染率已经高达10％。因此，由HBV感染导致的肝硬化在我国的发病逐年增加。据不完全统计，我国慢性乙型肝炎病人约为2000万人，其中近25～30万慢性乙肝病人可发展为肝硬化，其中5～20万可能发展为肝癌。而我国每年死于肝硬化的人数高达20万。并且研究表明，早期肝硬化可以通过治疗干预进行逆转。因此，如果能够发现易感人群并进行早期诊断和干预，则会大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，降低患者死亡率、减少医疗费用并提高患者的生活质量；同时，肝硬化易感人群的发现对于了解其发病机理并寻找干预手段也有重要科学意义和临床应用价值，这将对人类最终攻克这一顽疾有重要意义。人类血清淀粉样蛋白A(SerumAmyloidA,SAA)是一种由104个氨基酸组成的急性期反应蛋白，其在天然状态时的分子量大约为12-14kDa，其编码基因位于人类第11号染色体。早期的研究认为SAA是一种急性炎性蛋白，因为在急性炎症中，SAA可由肝脏活化的巨噬细胞和纤维母细胞合成，浓度达正常水平的100-1000倍(正常值一般为910±270微克/升)。此外，SAA可替代载脂蛋白A1(ApoA1)与高密度脂蛋白(HDL)结合，从而降低胆固醇的转运效率，并在炎症期间通过调节高密度脂蛋白代谢而使其抗炎作用转变为促炎作用，并进而引起肝脏损伤。近年来大量研究表明：SAA已经不仅是传统意义上的急性期炎症蛋白，而是作为一种天然固有免疫的调理素。SAA可与IL-6、TNF-a等炎症性细胞因子相互作用，参与调节机体的固有免疫和获得性免疫。如已经发现SAA在糖尿病、冠心病、类风湿性关节炎(RA)等慢性炎症疾病和自身免疫病的发生、发展中扮演了重要的角色。近来，在蛋白组学的研究中发现，SAA作为最重要的血清学标志物之一，与肝癌的发生发展密切相关。并且，在组化研究中，酒精性肝硬化的肝细胞腺瘤和结节中，同样发现了SAA的存在，预示其有可能是肝硬化的潜在标志物。另外，SAA蛋白氨基端的50－76个氨基酸片段可形成不可溶性的纤维，在肝脏沉积后可能会促进肝纤维化。除此之外，香港大学He博士等发现，在由肝炎引起的肝硬化及肝癌病人的肝组织中，SAA蛋白明显增高。众所周知，乙肝病毒感染后有着“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表现，其中肝硬化是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝细胞死亡并由肝脏纤维组织增生发展而来。其中，SAA是否参与上述病变至今未见明确报道。但是法国巴斯德研究所的研究表明：SAA蛋白与肝炎病毒的感染有着密切的关系，乙肝病毒X基因(该基因与肝硬化及肝癌形成有关)转基因小鼠的肝组织中SAA蛋白表达明显受抑，提示SAA可能与HBV感染和后续病变有关。存在于自然群体中基因片段的拷贝数变异(copynumbervariations,CNVs)是基因组结构性差异的常见形式，它在人群中普遍存在，随着实验技术的进步，越来越多的CNVs与疾病的相关性被陆续报道。人类CNVs与疾病发生和诊断与治疗有密切的关系，已有研究报道，CNVs与肝癌、脂肪肝、克隆氏病以及肺癌等的发生发展有关。但是SAA的基因拷贝数变异与肝硬化的相关性研究目前尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术首先提出SAACNVs与慢性乙型肝炎(以下简称慢性乙肝)及乙肝后肝硬化显著相关，并且评估了其成为乙肝后肝硬化生物标志物的可能性。本专利技术建立了一种SAA基因拷贝数变异的检测方法，首次提出SAA基因拷贝数变异在乙肝后肝硬化的发病、诊断和干预中的临床价值及应用。本专利技术通过对于SAACNVs的研究，建立乙肝后肝硬化生物标志物的拷贝数变异分析方法以及相关高特异性试剂盒，对于实现肝硬化早期诊断、预后转归，指导治疗等奠定了坚实基础。本专利技术提出了一种检测SAA1和/或SAA2基因拷贝数变异的试剂在制备对慢性乙型肝炎进行预后诊断、对慢性乙型肝炎发展为乙肝后肝硬化进行早期诊断及预后判断的产品中的应用。本专利技术还提出了一种检测SAA基因拷贝数变异的试剂在制备确定血中SAA蛋白水平的产品中的应用。本专利技术还提出了一种SAA1和/或SAA2基因拷贝数变异在作为对慢性乙型肝炎和/或乙肝后肝硬化进行预测、诊断、预后判断的生物标志物中的应用。本专利技术通过设计SAA(SAA1及SAA2)的高效特异性引物，采用改进的实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术，建立乙肝后肝硬化生物标志物的拷贝数变异分析方法以及相关试剂盒，并对SAA基因拷贝数进行分析，并研究SAA基因拷贝数与慢性乙型肝炎以及乙肝后肝硬化发病的关系。本专利技术研究结果表明：SAA基因拷贝数变异在中国人群的健康对照组，慢性乙型肝炎组及肝硬化组中的确存在显著性差异，而且其与肝硬化的发生发展显著相关，可作为潜在的生物标记物应用于肝硬化诊断/预后诊断。本专利技术还提出了一种SAA1特异性引物，上游引物：5’-3’TGGAGAAGTTAGAGGCTGCGGC；下游引物：5’-3’GGATGAAAACACTGGGCACCACC。本专利技术还提出了一种SAA2特异性引物，上游引物：5’-3’CTGTGGTCCCTCCTCTTCTTGCC；下游引物：5’-3’GGAGTGAAAACACTGACCCTGCCT。本专利技术还提出了一种内参引物，上游引物：5’-3’TCAGGCCCATGGGGCTCATT；下游引物：5’-3’GGGTCTGGAGAGGCCGACTTG。本专利技术还提出了如上所述的SAA1特异性引物，SAA2特异性引物和内参引物在制备检测SAA的基因拷贝数变异的产品中的应用。本专利技术还提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如上所述的SAA1特异性引物，SAA2特异性引物，内参引物，其中，引物浓度范围为(0.1-4.0μM)，引物长度范围为(20-30bp)，热启动Taq酶以及2xPCRMasterMix，阴性质控品，阳性质控品。本专利技术还提出了所述试剂盒在制备检测SAA的基因拷贝数变异的产品中的应用。本专利技术还提出了一种测定SAA的基因拷贝数变异的实时荧光定量PCR分析方法，在10μL微量PCR反应孔内加入以下试剂：加入去离子灭菌水至终体积10uL；其中，所述引物包括如上所述的SAA1特异性引物，SAA2特异性引物和内参引物，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：第一阶段95℃10分钟1循环第二阶段95℃15秒，65℃45秒40循环65℃收集荧光第三阶段60℃1分钟，95℃10秒1循环收集融解曲线第四阶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测SAA1和/或SAA2基因拷贝数变异的试剂在制备对慢性乙型肝炎进行预后诊断、对慢性乙型肝炎发展为乙肝后肝硬化进行早期诊断及预后判断的产品中的应用。

【技术特征摘要】
1.检测SAA1和/或SAA2基因拷贝数变异的试剂在制备对慢性乙型肝炎进行预后诊断、对慢性乙型肝炎发展为乙肝后肝硬化进行早期诊断及预后判断的产品中的应用。2.检测SAA基因拷贝数变异的试剂在制备确定血中SAA蛋白水平的产品中的应用。3.SAA1和/或SAA2基因拷贝数变异在作为对慢性乙型肝炎和/或乙肝后肝硬化进行预测、诊断、预后判断的生物标志物中的应用。4.一种SAA1特异性引物，其特征在于，上游引物：5’-3’TGGAGAAGTTAGAGGCTGCGGC；下游引物：5’-3’GGATGAAAACACTGGGCACCACC。5.一种SAA2特异性引物，其特征在于，上游引物：5’-3’CTGTGGTCCCTCCTCTTCTTGCC；下游引物：5’-3’GGAGTGAAAACACTGACCCTGCCT。6.一种内参引物，其特征在于，上游引物：5’-3’TCAGGCCCATGGGGCTCATT；下游引物：5’-3’GGGTCTGGAGAGGCCGACTTG。7.如权利要求4所述的SAA1特异性引物，如权利要求5所述的SAA2特异性引物，如权利要求6所述的内参引物在制备检测SAA的基因拷贝数变异的产品中的应用。8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求4所述的SAA1特异性引物，如权利要求5所述的SAA2特异性引物，如权利要求6所述的内参引物，其中，引物浓度范围为0.1-4.0μM，引物长度范围为20-30bp，热启动Taq聚合酶以及2xPCRMasterMi...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳，王荣芳，施长根，钱震斌，
申请(专利权)人：德赛诊断系统上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31