烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体及其编码基因和应用，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基氨酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。通过将编码本发明专利技术突变体的基因转入到目标植物中，能够使得目标植物获得对PPO酶抑制剂(除草剂)的抗性，但酶本身的催化活性不受太大影响。因此，本发明专利技术的突变体及其编码基因可用于培育具有除草剂抗性的植物。

Protoporphyrinogen oxidase mutants of tobacco mitochondria and their coding genes and Applications

【技术实现步骤摘要】
烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体及其编码基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体，编码该突变体的基因、含有该基因的重组载体和重组细胞，以及他们在提高作物除草剂抗性中的应用。
技术介绍
来自烟草线粒体(NicotianatabacumPPO2)的原卟啉原氧化酶于1997年由Grimm组首次克隆成功[5]。研究表明其以二聚体形式存在，由504个氨基酸组成，分子量约为55kD。2004年，Koch等人报道了其晶体结构，他们定义了三个结构域：FAD结合域，底物结合域和膜结合域。1997年首次克隆成功烟草线粒体原卟啉原氧化酶后，Koch等人应用stop-flow的方法以ProtoporphyrinogenIX为底物得到了烟草线粒体米氏常数Km＝1.17μM，kcat＝360min-1。1997年Grimm课题组报道了抑制剂三氟羧草醚对烟草线粒体原卟啉原氧化酶的IC50<100nM，这比人体原卟啉原氧化酶对抑制剂还要敏感10倍以上。烟草线粒体PPO酶位于线粒体中，也是一种跨膜蛋白，同样具有溶解性低的性质。目前对其的研究同样是基于天然底物protoporphyrinogenIX的基础之上。烟草线粒体PPO酶是第一个报道的PPO酶晶体结构的种属，给科研工作者提供了结构上的信息，对科研工作者的研究具有极大的指导意义，因此对这样一个种属的研究也显得特别的重要。它的研究价值还体现在它的农学研究上，作为农药研究的重要靶标酶，烟草线粒体原卟啉原氧化酶理所当然成为了最佳选择。通过这样一种有晶体结构的酶，可以研究商品化除草剂以及新合成的抑制剂与酶之间的相互作用，可以研究抑制剂的抗性以及研发新型抑制剂。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人在对烟草线粒体PPO酶研究的基础上发现，通过突变其353位点、356位点和372位点中的至少一种，并将突变体编码基因转入到目标植物中，能够使目标植物获得提高的除草剂抗性。因此，第一方面，本专利技术提供了一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体，所述突变体为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基氨酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由SEQIDNO：1衍生的蛋白质。第二方面，本专利技术提供了一种能够编码如上所述的烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体的基因。第三方面，本专利技术提供了一种含有如上所述的基因的重组载体。第四方面，本专利技术提供了一种含有如上所述的重组载体的重组细胞。第五方面，本专利技术提供了如上所述的原卟啉原氧化酶突变体、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组细胞在提高作物除草剂抗性中的应用。第六方面，本专利技术提供了一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：(a)将如上所述的重组载体转入目标植物，使目标植物表达如上所述的突变体，以获得对除草剂抗性；或者(b)通过杂交、转育或回交，将含有如上所述的重组载体的突变作物中的重组载体转移到目标植物中，使目标植物表达如上所述的突变体，以获得对除草剂抗性。通过将编码本专利技术突变体的基因转入到目标植物中，能够使得目标植物获得对PPO酶抑制剂(除草剂)的抗性，但酶本身的催化活性不受太大影响。因此，本专利技术的突变体及其编码基因可用于培育具有除草剂抗性的植物。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为测试例1测试的六类具有代表性的商品化除草的分子结构式。图2为测试例中目的基因扩增所采用的PCR程序。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。第一方面，本专利技术提供一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶(以下简称为PPO酶)突变体，所述突变体为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基氨酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由SEQIDNO：1衍生的蛋白质。SEQIDNO：1MAPSAGEDKHSSAKRVAVIGAGVSGLAAAYKLKIHGLNVTVFEAEGKAGGKLRSVSQDGLIWDEGANTMTESEGDVTFLIDSLGLREKQQFPLSQNKRYIARNGTPVLLPSNPIDLIKSNFLSTGSKLQMLLEPILWKNKKLSQVSDSHESVSGFFQRHFGKEVVDYLIDPFVAGTCGGDPDSLSMHHSFPELWNLEKRFGSVILGAIRSKLSPKNEKKQGPPKTSANKKRQRGSFSFLGGMQTLTDAICKDLREDELRLNSRVLELSCSCTEDSAIDSWSIISASPHKRQSEEESFDAVIMTAPLCDVKSMKIAKRGNPFLLNFIPEVDYVPLSVVITTFKRENVKYPLEGFGVLVPSKEQQHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPNNVYLYTTFVGGSRNRELAKASRTELKEIVTSDLKQLLGAEGEPTYVNHLYWSKAFPLYGHNYDSVLDAIDKMEKNLPGLFYAGNHRGGLSVGKALSSGCNAADLVISYLESVSTDSKRHC其中，酶活力不变是指在相同的测定条件下，由SEQIDNO：1衍生的蛋白质的酶活力与SEQIDNO：1的酶活力之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。尽管本专利技术的专利技术人发现，只要突变SEQIDNO：1中的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点，便能够获得具有PPO酶抑制剂抗性的突变体，但本专利技术的进一步专利技术人发现，将353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基酸取代为另外的非极性氨基酸、不带电荷的极性氨基酸和带正电荷的极性氨基酸中的一种，所获得的PPO酶抑制剂抗性能够得到进一步提高。进一步优选的，所述SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中至少一个位点的非极性氨基氨酸被丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和组氨酸中的一种所取代。更进一步优选的，所述突变体含有至少1种如下的突变：位点356的亮氨酸突变为丙氨酸、位点356的亮氨酸突变为苏氨酸、位点356的亮氨酸突变为组氨酸、位点356的亮氨酸突变为苯丙氨酸、位点356的亮氨酸突变为色氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为丙氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为苏氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为组氨酸和位点372的亮氨酸突变为苏氨酸。根据本专利技术一种具体的实施方式，所述突变体为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的356位点突变为丙氨酸所获得的蛋白，称为L356A。根据本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基氨酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基氨酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由SEQIDNO：1衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中至少一个位点的非极性氨基氨酸被另外的非极性氨基酸、不带电荷的极性氨基酸和带正电荷的极性氨基酸中的一种所取代。3.根据权利要求2所述的突变体，其中，所述SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中至少一个位点的非极性氨基氨酸被丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和组氨酸中的一种所取代。4.根据权利要求3所述的突变体，其中，所述突变体含有至少1种如下的突变：位点356的亮氨酸突变为丙氨酸、位点356的亮氨酸突变为苏氨酸、位点356的亮氨酸突变为组氨酸、位点356的亮氨酸突变为苯丙氨酸、位点356的亮氨酸突变为色氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为丙氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为苏氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为组氨酸和位点372的亮氨酸突变为苏氨酸；优选的，所述突变体为L356A、L356T、L356H、L356F、L3...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光富，席真，郝格非，牛聪伟，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42