Na制造技术

本发明专利技术公开了Na

Na

【技术实现步骤摘要】
Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法
本专利技术涉及生物医疗
，特别涉及Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法。
技术介绍
卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一,死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤的首位，严重威胁女性身体健康和生命。卵巢癌发病隐匿，缺乏早起诊断标志，多数患者被确诊时已经属于晚期。目前，临床对于卵巢癌的首选治疗方法是肿瘤减灭术与以铂类药物为主的联合治疗方法。但是化疗使肿瘤细胞产生的耐药性，导致患者5年生存率徘徊在40%，严重影响了治疗效果。卵巢癌的化疗耐药常表现为多药耐药(multidnugresistance,MDR),其耐药机制主要有:药代动力学、药物作用靶点、DNA损伤修复系统、细胞调亡调控、肿瘤微环境、细胞外信号转导通路、微小RNA、肿瘤干细胞及上皮间质转化等。无论何种机理存在，细胞内pH值增高是耐药细胞株所具有的共同改变，这就为肿瘤耐药的逆转研究提供了一个新的方向。目前，化疗仍然是临床中对肿瘤的治疗的主要对策之一，但化疗产生的肿瘤多耐药性却是降低疗效的一个重大的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，本专利技术在卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol中，EIPA诱导的细胞酸化抑制了PIK3/Akt信号通路的作用，进而降低MRP-1的表达及其向外转运药物的作用，能够增加抗肿瘤药物在卵巢癌细胞内的积累，提高化疗药物的疗效，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，包括如下步骤：S1：准备药物与试剂材料为：乙基异丙基氨氯吡咪、顺铂、紫杉醇、卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol、反转录酶试剂盒、荧光染料SYBRGreenreal-timePCR反应液、Rh123、Trizol、Q-PCR引物、兔抗人β-actin、MDR-1抗体、兔抗人PI3K、Akt-1抗体、优质胎牛血清、Annexin-V細胞凋亡试剂盒、RMP11640培养基；S2：细胞培养及实验分组卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol培养于含800ng/mlTaxol、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37C、5%CO2培养箱中孵育，实验分4组：空白对照组、顺铂组、乙基异丙基氨氯吡咪组、乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂组；S3：MTT法检测乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50取对数生长期的细胞A2780/Taxol，0.25%的胰蛋白酶消化，离心，RPMI1640培养基调整细胞密度为5x105个/m1，接种至96孔细胞培养板中，每孔加100μ1细胞悬液，每个组设6个复孔，培养板放入CO2培养箱中孵育，细胞贴壁后加入乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂，24小时和48小时分别取出培养板，每孔加入MTT溶液20μl，放入37摄氏度培养中4小时，吸去孔中液体，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490nm波长检测OD值，计算乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50；S4：Hoechst33258染色检测细胞调亡将灭菌的盖玻片置于6孔板中，接种A2780/Taxol细胞悬液，5x10个/孔，37℃培养箱培养24h，实验组分别加入IC50浓度的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂，继续培养24h、36h、48h，除去培养液，用PBS清洗细胞3次，每孔加入1ml的Hoechst33258染色液，室温放置3-5分钟，吸除Hoechst33258染色液，用PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟，封片后荧光显微镜下观察拍照；S5：QuantativeReal-timePCR法检测A2780/Taxol细胞中目的基因的含量Trizol法提取各组总RNA，酶标仪检测OD260/0D280在1.8-2.0之间的，表明RNA纯度好，按逆转录试剂盒要求合成cDNA，将合成的cDNA稀释后，冰上配置20μl的PCR反应体系，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为95C30s预变性，然后95C5s，60C35s，共35个循环，实验重复3次，以B-actin为内参基因，用2-△△ct法计算各基因mRNA的相对表达量；S6：Westernblot法检测PI3K、Akt蛋白及MRP-1的表达量参照SDS-聚丙烯酰胺快速凝胶试剂盒说明制备5%的浓缩胶及10%的分离胶，调整各组蛋白样品上样量20μg，按照浓缩胶60V，分离胶100V的电压将蛋白质进行垂直凝胶电泳后，半干法转移至NC膜，洗膜后，快速封闭液封闭15分钟，分别加入稀释的PI3K、Akt及MRP-1的兔抗人抗体，4C孵育过夜，洗涤3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育1.5小时，再次洗涤3次，每次3分钟，超敏化学发光试剂盒检测信号，内参为β-actin，以目的蛋白条带的灰度值/内参条带的灰度值表示目的蛋白的相对表达量；S7：细胞内Rh123的积累取对数生长期的A2780/Taxol细胞，实验分组同上，继续培养24h小时，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后，在含有5μMRh123的RMPI1640培养基中37C孵育60分钟，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，流式细胞仪激发波长488nm、发射波长530nm检测细胞内细胞内平均荧光强度，以此观察细胞内Rh123的的含量；S8：统计学分析采用SPSS16.0统计软件包，对数据进行检验，所有数据均采用mean+SD方式表示，用单因素方差分析检验总体均数差异性，有显著性差异者再进行两两比较，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异极显著性。进一步地，S2的10%胎牛血清的RPMI1640培养基含100U/m1的青霉素和链霉素。进一步地，S3的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂均设置6.25μM、12.5μM、25μM、50pM、100μM5个浓度。进一步地，S3的抑制率=(OD实验组-OD对照组)/OD对照组X100%。进一步地，S3的MTT溶液浓度为5mg/ml。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提出的Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，使用Na+-H+交换器抑制剂，乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂处理卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol,MTT实验、Hochest33258染色分别检测EIPA及顺铂对A2780/Taxol的IC50和调亡形态学变化;QuantativeReal-timePCR、Westernblot法分别检测磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路中PI3K、Akt-1蛋白及多耐药相关蛋白MRP-1的表达量；流式细胞术检测细胞内Rh123的含量，在卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol中，EIPA诱导的细胞酸化抑制了PIK3/Akt信号通路的作用，进而降低MRP-1的表达及其向外转运药物的作用，能够增加抗肿瘤药物在卵巢癌细胞内的积累，提高化疗药物的疗效。附图说明图1为本专利技术的EIPA与DDP对卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol生长抑制作用图；图2为本专利技术的细胞凋亡形态学检测图；图3为本专利技术的目的基因表达量**与DDP组对比图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Na

【技术特征摘要】
1.Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：准备药物与试剂材料为：乙基异丙基氨氯吡咪（EIPA）、顺铂(DDP)、紫杉醇(Taxol)、卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol、反转录酶试剂盒、荧光染料SYBRGreenreal-timePCR反应液、Rh123、Trizol、Q-PCR引物、兔抗人β-actin、MDR-1抗体、兔抗人PI3K、Akt-1抗体、优质胎牛血清、Annexin-V細胞凋亡试剂盒、RMP11640培养基；S2：细胞培养及实验分组卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol培养于含800ng/mlTaxol、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37C、5%CO2培养箱中孵育，实验分4组：空白对照组、顺铂组、乙基异丙基氨氯吡咪组、乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂组；S3：MTT法检测乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50取对数生长期的细胞A2780/Taxol，0.25%的胰蛋白酶消化，离心，RPMI1640培养基调整细胞密度为5x105个/m1，接种至96孔细胞培养板中，每孔加100μ1细胞悬液，每个组设6个复孔，培养板放入CO2培养箱中孵育，细胞贴壁后加入乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂，24小时和48小时分别取出培养板，每孔加入MTT溶液20μl，放入37摄氏度培养中4小时，吸去孔中液体，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490nm波长检测OD值，计算乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC50；S4：Hoechst33258染色检测细胞调亡将灭菌的盖玻片置于6孔板中，接种A2780/Taxol细胞悬液，5x10个/孔，37℃培养箱培养24h，实验组分别加入IC50浓度的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂，继续培养24h、36h、48h，除去培养液，用PBS清洗细胞3次，每孔加入1ml的Hoechst33258染色液，室温放置3-5分钟，吸除Hoechst33258染色液，用PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟，封片后荧光显微镜下观察拍照；S5：QuantativeReal-timePCR法检测A2780/Taxol细胞中目的基因的含量Trizol法提取各组总RNA，酶标仪检测OD260/0D280在1.8-2.0之间的，表明RNA纯度好，按逆转录试剂盒要求合成cDNA，将合成的cDNA稀释后，冰上配置20μl的PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍静，
申请(专利权)人：长治医学院，
类型：发明
国别省市：山西,14