检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物和探针组合及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN的特异性引物组合和探针组合，包括对五种糖肽类药物耐药基因进行特异性扩增的引物组合，还包括检测五种糖肽类药物耐药基因的特异性探针。本发明专利技术还同时公开了利用该特异性引物和探针组合进行检测五种糖肽类药物耐药基因的方法。本发明专利技术具有高特异性和涵盖度，不仅可用于对人体感染样本中vanC、vanE、vanG、vanL和vanN耐药基因的检测，提示对万古霉素等的耐药程度；还可用于动物及环境样本中五种糖肽类药物耐药基因的分布及转移情况的监测。

Specific primers and probe combinations for detection of five glycopeptide resistance genes in Enterococcus bacteria and their application

【技术实现步骤摘要】
检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物和探针组合及应用
本专利技术涉及生物
中，检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物探针组合及其应用。涉及的VanC、VanE、VanG、VanL和VanN操纵子的耐药机制为通过将肽聚糖前体C端d-ala残基替换为d-ser使宿主产生耐药，仅对万古霉素表现出中低程度的耐药，而对替考拉宁无效。
技术介绍
糖肽类抗生素(Glycopeptides，GAPs)是一类具有七肽结构的抗生素，由氨基酸与糖残基、氯原子、甲基和/或脂链组成。用于治疗人类感染的重要的糖肽类抗生素包括第一代万古霉素(Vancomycin)和替考拉宁(Teicoplanin)，尽管二者分别早在1958年和1988年就被批准用于临床，但目前仍在临床实践中广泛使用。第二代糖肽类抗生素Telavancin、Dalbavancin和Oritavancin分别于2013年和2014年被批准用于临床。与第一代糖肽类抗生素相比，第二代抗生素表现出更强的抗菌能力和更优越的药代动力学特性。糖肽类药物通过结合到细菌细胞壁肽聚糖前体的d-ala-d-ala末端来抑制肽聚糖(PG)的合成，使细菌不能正常合成细胞壁，从而达到抗菌效果。GAPs是治疗由革兰氏阳性病原体(如金黄色葡萄球菌、肠球菌属和艰难梭菌)引起的严重感染的最后手段。1988年欧洲首次报道了耐万古霉素肠球菌临床分离株。从那时起，耐万古霉素的肠球菌以意想不到的速度传播，现在在大多数国家的医院都有发现。研究发现，细菌对糖肽类药物的抗性是由于细菌中存在编码一系列蛋白的操纵子，其产物用来合成与糖肽类药物低亲和力的肽聚糖前体，包括肽聚糖前体C端d-ala残基被d-lac或d-ser取代，通过修饰糖肽类药物结合靶点使其失效；或者是由于细菌编码蛋白，消除通常由宿主产生的高亲和力前体，去除糖肽类药物结合靶点，从而产生耐药。目前已经在革兰氏阳性菌中发现13类糖肽类耐药操纵子，其中9种存在于肠球菌，4种存在于其他革兰氏阳性菌中。肠球菌中发现的VanA、VanB、VanD和VanM操纵子组成虽有差异，但其核心的耐药机制都是通过将肽聚糖前体C端d-ala残基替换为d-lac，降低糖肽类药物与肽聚糖前体的亲和力，最终表现为对万古霉素的高度耐药，以及对替考拉宁(VanB除外)的高度耐药。而VanC、VanE、VanG、VanL和VanN操纵子的耐药机制与上述几种操纵子略有不同，通过将肽聚糖前体C端d-ala残基替换为d-ser使宿主产生耐药，但仅对万古霉素表现出中低程度的耐药，而对替考拉宁无效。目前对糖肽类药物耐药性的检测方法有两类，即表型检测和基因型检测。表型检测通过在糖肽类药物存在的情况下培养病原菌，通过抑菌圈大小，或测定半致死药物浓度(MIC50)进行。表型检测步骤复杂，耗时长，整个过程至少需48-72小时，病原菌分离培养过程中，由于没有抗生素选择压力，可能使携带Van操纵子的质粒等发生丢失，导致后续的药物敏感性检测得出假阴性的结果。有鉴于此，国际上越来越多的细菌耐药性研究者建议采用基因型检测方法。通过聚合酶链式反应(PCR)、测序等方法，直接检测细菌是否携带与糖肽类药物耐药性相关的基因，其优点是可提供基因水平的耐药信息，可在样品收集后24小时内得到结果，技术步骤较少，一般情况下费用较便宜。但PCR方法也存在仅根据扩增产物片段大小判断结果的不确定性，以及测序数据分析较复杂等缺点，影响检测结果可靠性和广泛推广。现有的基因型检测方法多针对VanA、VanB型糖肽类耐药基因，而针对本专利技术所涉及的VanC、VanE、VanG、VanL和VanN型糖肽类耐药基因的检测方法极少报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一组特异性检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN的引物探针组合及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物组合和探针组合：包括对五种糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN进行特异性扩增的引物组合，引物如序列1-10所示；还包括检测五种糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN的特异性探针组合，探针如序列11-15所示。引物组1包括vanC基因特异性引物，具体为vanC基因正向引物(序列1)和vanC基因反向引物(序列2)；引物组2包括vanE基因特异性引物，具体为vanE基因正向引物(序列3)和vanE基因反向引物(序列4)；引物组3包括vanG基因特异性引物，具体为vanG基因正向引物(序列5)和vanG基因反向引物(序列6)；引物组4包括vanL基因特异性引物，具体为vanL基因正向引物(序列7)和vanL基因反向引物(序列8)，引物组5包括vanN基因特异性引物，具体为vanN基因正向引物(序列9)和vanN基因反向引物(序列10)。本专利技术设计的引物组合具有相同的参数范围，以保证各组引物在相同的反应条件下都能正常工作。具体为：引物长度范围在15-25个寡核苷酸之间，最优为20个寡核苷酸；引物Tm值范围在45-65℃之间，最优为56℃；正向、反向引物之间Tm值最多相差3℃，最优为0℃；PCR产物长度范围在100-1000bp之间，最优为200-400bps。所述的探针组合由探针1-5组成。探针1包括vanC基因特异性探针(序列11)；探针2包括vanE基因特异性探针(序列12)；探针3包括vanG基因特异性探针(序列13)；探针4包括vanL基因特异性探针(序列14)；探针5包括vanN基因特异性探针(序列15)。本专利技术设计的探针具有相同的参数范围，以保证各个探针在相同的反应条件下都能正常工作。具体为：探针长度范围在15-30个寡核苷酸之间，最优为20个寡核苷酸；探针的杂交温度范围在48-70℃之间，最优为56℃；探针的GC含量范围在20％-80％之间，最优为50％。具体如下表1所述：表1所述引物组合中，所述引物组1、2、3、4、5的摩尔比可为1:1.5:1.5:1:1。所述探针组合中，所述探针1、2、3、4、5在杂交反应中应等量应用。本专利技术还同时提供了特异性检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的试剂盒，包括如上所述的引物组合(如序列1-10所示)和特异性探针组合(如序列11-15所示)。作为本专利技术的试剂盒的改进：还包括PCR扩增反应液、杂交反应液。注：PCR扩增反应液和/或杂交反应液可以是商品化的PCR扩增反应液和/或杂交液，也可以是符合PCR扩增和杂交反应原理的自制反应液。作为本专利技术的引物探针组合、试剂盒的应用，为以下任一用途：1)、鉴定耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN中的至少一种(即，为任意一种，或任意2种、3种、4种的组合)；2)、检测待测菌是否含有糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN中的至少一种；3)、检测待测样本中是否含有糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN中的至少一种。作为本专利技术的引物探针组合、试剂盒的应用的改进：1)、提取待测样本/待测菌的总DNA；2)、以步骤1)提取的总DNA为模本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因(vanC、vanE、vanG、vanL和vanN)的引物探针组合，其特征是：包括对五种糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN进行特异性扩增的引物组合，所述引物如序列1‑10所示；还包括检测五种糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN的特异性探针组合，所述探针如序列11‑15所示。

【技术特征摘要】
1.特异性检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因(vanC、vanE、vanG、vanL和vanN)的引物探针组合，其特征是：包括对五种糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN进行特异性扩增的引物组合，所述引物如序列1-10所示；还包括检测五种糖肽类药物耐药基因vanC、vanE、vanG、vanL和vanN的特异性探针组合，所述探针如序列11-15所示。2.特异性检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：包括如权利要求1所述的引物组合和特异性探针组合。3.根据权利要求2所述的特异性检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：还包括PCR扩增反应液、杂交反应液。4.引物探针组合、试剂盒的应用，其特征是为以下任一用途：1)、鉴定耐药基因v...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琼，孟晓华，刘芳，周佳维，吴灵娇，倪淑君，胡绍华，苏琨楷，姚坚，刁宏燕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33