人间皮素嵌合抗原受体、其T细胞及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种人间皮素嵌合抗原受体、其T细胞及其制备方法和用途，该间皮素嵌合抗原受体包含抗‑间皮素scFv抗体、以及CD8铰链区、CD28跨膜区、CD3胞内区和41BB胞内区，还提供编码它的核酸，包含该核酸的载体，包含该载体的宿主细胞；还提供一种使用上述载体转导人CD8+/CD4+T细胞获得CARmesothelin‑T细胞的方法。该细胞为T细胞经过基因修饰和改造得到，可用于治疗间皮素表达相关疾病，尤其是特异性识别和杀伤表达间皮素的肿瘤。

Receptor of human mesothelin chimeric antigen, its T cell, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
人间皮素嵌合抗原受体、其T细胞及其制备方法和用途
本专利技术属于肿瘤治疗
，具体涉及一种将T细胞进行基因工程以表达嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，CAR)用于治疗与间皮素的表达相关的疾病。
技术介绍
2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。针对肿瘤，传统的手术切除、化疗、放射线治疗，对正常组织有伤害，具有局限性，效果有限。近年来出现的靶向疗法在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，不会伤及肿瘤周围的正常组织细胞；但分子靶向药物有效性低，某种药物只能对特定突变基因型肿瘤产生作用；肿瘤基因突变产生药物耐受性导致长期的治疗效果下降；存在严重的不良反应；部分肿瘤不能通过靶向药物得到有效治疗。新的免疫疗法正能够解决这些问题。肿瘤免疫治疗通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤能力，从而控制和杀伤肿瘤细胞；当免疫系统由于自身或肿瘤细胞原因被削弱时，为肿瘤的发生提供有利条件。肿瘤免疫疗法即通过加强免疫系统在各步骤中对肿瘤细胞的识别与杀伤能力。近年来，随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。自2013年以来，肿瘤细胞及免疫疗法不断获得突破性进展，临床研究也取得了巨大成功，是当前肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。细胞治疗方法包括非特异性免疫疗法和特异性免疫疗法。后者又包括单克隆抗体，过继细胞疗法(ACT)：TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)、CAR-T和TCR(T细胞受体)，DC(树突状细胞)疫苗和肿瘤疫苗等。肿瘤特异性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)细胞是体内杀伤肿瘤细胞的直接效应细胞，通过细胞表面的TCR识别肿瘤细胞表面呈递的肿瘤抗原和HLA分子复合物，激活CTL细胞内一系列反应，通过分泌穿孔素、颗粒酶等直接杀伤肿瘤细胞。近年来科学家们研究了肿瘤突变产生的新表位对机体抗肿瘤作用的影响，有望推动肿瘤特异性T细胞治疗技术的进步和临床应用。现有临床研究表明，肿瘤组织处肿瘤特异性突变，尤其是免疫原性区域抗原的突变，能够产生新的、肿瘤特异性抗原，这些抗原能够激发体内特异性T细胞免疫反应，产生的T细胞表面TCR亲和力较高，从而有效发挥肿瘤细胞杀伤功能。然而肿瘤组织处的免疫耐受环境限制了特异性T细胞的有效激活和功能发挥，需要体外环境下实施人为干预，对突变抗原特异性T细胞进行体外扩增和活化。新鲜外周血中CD4+/CD8+T细胞比例约为2:1。在T细胞分化过程中，T细胞经历T细胞、效应性T细胞、效应性记忆性T细胞和中枢记忆性T细胞的不同时期，其分化增殖的能力各不相同。T细胞分化过程中，其细胞表面标识发生逐渐变化，表现为CD45RA由阳性逐渐变为阴性，而CD62L逐渐由阴性变为阳性，双染色分析表现为：细胞表征为CD45RA+/CD62L+；效应性T细胞表征为CD45RA+/CD62L-；效应性记忆性T细胞表征为CD45RA-/CD62L-；中枢记忆性T细胞表征为CD45RA-/CD62L+。在免疫细胞治疗过程中，终末分化的T细胞由于其分化增殖能力相对较差，而早期T细胞能够快速反应并且能够大量增殖，对于肿瘤等的治疗具有更加持久的作用时间，T细胞培养过程中产生的T细胞分群对于后期免疫细胞治疗效果具有重要意义，含有较高含量的早期T细胞同时富集CD4+/CD8+T细胞的培养方法在临床上具有需求。细胞免疫治疗目前已经广泛开展，从早期的LAK细胞治疗尝试，发展到CIK(细胞因子诱导的杀伤细胞)、DC-CIK细胞治疗等。CIK细胞由IFN-γ，IL-2及抗-CD3抗体(OKT3)刺激后分化产生，其中在第0天加入1,000IU/ml的IFN-γ，24小时后加入50ng/mlOKT3和300IU/mlIL-2，中间间隔2天加入含IL-2的新鲜培养基，之后经过2-3周的培养可得到CIK细胞。嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗方法(CAR-T)是提取患者外周血中的普通T细胞，通过病毒载体引入新的基因，使其表达能够识别癌细胞抗原的受体，在受体另一端嵌合激活T细胞的元件，并在嵌合蛋白中引入多个共刺激分子，使得T细胞的生存能力、增殖能力、记忆效应增强，从而激活引导T细胞寻找杀死癌细胞。CAR-T细胞使用特异性抗原不依赖于HLA复合体的抗体轻链和重链的单链可变区(scFv)。一代CAR包括scFv，一段跨膜区，CD3ζ链(TCR复合体的信号域)，仅可向T细胞提供1类刺激信号，对于重复抗原刺激，可能导致T细胞无反应；二代CAR包括额外的共刺激区域，可提供针对靶向抗原的scFv的2类刺激信号。目前常用的共刺激分子有CD28或41BB的信号域，其他的分子也在研究。现有临床试验均采用二代CAR；另外，还有三代CAR加入两个共刺激区域，还包括其他基因，编码可提高T细胞存活或调节肿瘤微环境的蛋白等。Mesothelin(MSLN，间皮素)是一个通过糖磷脂酰肌醇区域(GPIdomain)连接在细胞膜上的糖蛋白。MSLN基因首先合成71kDa细胞表面蛋白，然后N端被弗林蛋白酶切除后，40kDa的C端留在细胞膜上，可溶的31kDa的N端片段MPF(megakaryoticpotentiatingfactor，巨核细胞增强因子)被释放。MSLN在正常的组织中并非必须的，在包括间皮在内的正常成人组织中存在很少，但在例如间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌中不正常的大量表达(ChangK,PastanI.Molecularcloningofmesothelin,adifferentiationantigenpresentonmesothelium,mesotheliomas,andovariancancers.ProcNatlAcadSciUSA1996；93:136–40.)。过量的间皮素表达首先在间皮瘤和卵巢癌中被发现，之后又相继在肺癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、胆道癌、子宫内膜癌、胸腺癌、结肠癌、乳腺癌中被发现(MorelloA,SadelainM,AdusumilliPS.Mesothelin-TargetedCARs:DrivingTcellstoSolidTumors[J].CancerDiscovery,2015,6(2).)。间皮素的表达在90％的类上皮恶性胸膜间皮瘤，69％肺腺癌，60％乳癌，46％食道癌中被发现(MorelloA,SadelainM,AdusumilliPS.Mesothelin-TargetedCARs:DrivingTcellstoSolidTumors[J].CancerDiscovery,2015,6(2))。间皮素在更具有侵略性的肺癌，乳腺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述的CAR包含：i)含有人抗间皮素结合结构域的抗体或抗体片段，ii)跨膜结构域，和细胞内信号传导结构域，其特征在于所述的抗间皮素结合结构域由包含一个或多个含有或选自以下的重链互补决定区(CDR)序列和/或轻链互补决定区(CDR)序列编码：(a)包含SEQ ID NO:1所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:2所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQ ID NO:3所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQ ID NO:4所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:5所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQ ID NO:6所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3；(b)包含SEQ ID NO:7所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:8所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQ ID NO:9所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQ ID NO:10所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:11所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQ ID NO:12所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3；或(c)包含SEQ ID NO:13所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:14所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQ ID NO:15所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQ ID NO:16所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQ ID NO:17所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQ ID NO:18所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3。...

【技术特征摘要】
1.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述的CAR包含：i)含有人抗间皮素结合结构域的抗体或抗体片段，ii)跨膜结构域，和细胞内信号传导结构域，其特征在于所述的抗间皮素结合结构域由包含一个或多个含有或选自以下的重链互补决定区(CDR)序列和/或轻链互补决定区(CDR)序列编码：(a)包含SEQIDNO:1所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQIDNO:2所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQIDNO:3所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQIDNO:4所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQIDNO:5所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQIDNO:6所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3；(b)包含SEQIDNO:7所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQIDNO:8所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQIDNO:9所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQIDNO:10所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQIDNO:11所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQIDNO:12所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3；或(c)包含SEQIDNO:13所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)1；包含SEQIDNO:14所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)2；包含SEQIDNO:15所示核酸序列或其修饰的重链互补决定区(CDR)3；包含SEQIDNO:16所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)1；包含SEQIDNO:17所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)2；和包含SEQIDNO:18所示核酸序列或其修饰的轻链互补决定区(CDR)3。2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述的抗间皮素结合结构域的抗体或抗体片段：(a)与SEQIDNO:31的序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；(b)与SEQIDNO:33的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫红，靳文静，陈瑜，谭曙光，
申请(专利权)人：英威福赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12