一种水稻胞质激酶编码基因OsRLCK5及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻胞质激酶编码基因OsRLCK5及其应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术通过基因工程手段将胞质类受体激酶OsRLCK5基因与过表达载体连接后，转化至水稻中，提高该基因在转化后的水稻植株中的表达，可以使该水稻植株对纹枯病的抗性提高；另外可以过量表达其它植物中该基因同源基因的表达，而增强其它植物的抗病性。另外，还可利用此OsRLCK5基因编码的蛋白为诱饵蛋白钓出水稻或其它植株中与该蛋白互作的蛋白，明确该基因在抗纹枯病过程中的调控模式。

A Rice Cytoplasmic Kinase Coding Gene OsRLCK5 and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种水稻胞质激酶编码基因OsRLCK5及其应用
本专利技术属基因工程
，具体涉及一种水稻胞质激酶编码基因OsRLCK5及其应用。
技术介绍
水稻是重要的粮食作物，其生产直接影响我国国民的经济发展。水稻纹枯病是由立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的一种土传真菌病害，与稻瘟病和白叶枯病并称为水稻三大病害，在某些纹枯病高发区能造成50％的减产，且有逐年加重的趋势，已经成为限制水稻高产的主要病害因素。近年来，随着气候变化的同时水稻高产、粗秆、多孽、大穗型种质的推广种植，种植密度加大以及氮肥的过量施用，使田间通风差、湿度大，为纹枯病菌侵染寄主创造了有力的环境条件。目前，由于抗纹枯病水稻种质资源的缺乏、病原菌寄主范围广、抗逆性强以及遗传变异等因素，对纹枯病的防治仍没有较为系统的方法。在农业生产上，主要采用化学药剂对水稻纹枯病进行防控，但化学药剂对环境的影响以及造成病原菌耐药性等问题随之而来。在全球大部分水稻种植区，90％以上的水稻品种表现不同程度的感病。关于抗水稻纹枯病相关QTL和基因虽然已有报道，然而由于田间纹枯病的发生及病害流行受到如水稻长势、冠层密度以及田间农艺操作等多重因素的影响，并且在纹枯抗性鉴定方面如接种方法、病害调查及分级标准也不尽统一，导致调控纹枯病抗性的主效基因及QTL仍未解析清楚，抗纹枯病育种进展缓慢。因此，对水稻纹枯病抗性相关基因的研究不仅具有重大的理论意义，同时能够促进水稻抗纹枯病种质资源挖掘和遗传改良，最终达到对纹枯病的有效防控和农业的增产增收。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种水稻胞质激酶编码基因OsRLCK5，以及该基因在抗水稻纹枯病中的应用，为培育抗纹枯病水稻品种提供新的方法。为达上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：提供一种正向调控水稻纹枯病抗性的胞质类受体激酶OsRLCK5基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步，将该基因与植物过表达载体连接重组后，转化至水稻感纹枯病品种Lement中，发现转基因水稻中该基因的表达水平提高，且对纹枯病的抗性提高；将该基因与植物干涉载体连接重组后，转化至水稻抗纹枯病品种特青中，发现转基因水稻中该基因的表达水平降低，且对纹枯病的抗性降低。通过在水稻中过量表达该基因，可以获得抗纹枯病水稻植株，可用于抗纹枯病水稻品种的选育。本专利技术还提供了一种含有上述基因的过表达载体，以及含有该过表达载体的农杆菌菌株。本专利技术的用途为：(1)本专利技术通过基因工程手段将胞质类受体激酶OsRLCK5基因与过表达载体连接后，转化至水稻中，提高该基因在转化后的水稻植株中的表达，可以使该水稻植株对纹枯病的抗性提高；另外可以利用该基因过量表达其它植物中其同源基因的表达，而增强其它植物的抗病性。(2)用于水稻抗纹枯病机制的解析，如将该基因序列连接到任何一种含有荧光蛋白基因的转化载体上，用任何一种转化方法将该基因和荧光蛋白基因共价导入水稻或其它植物细胞，利用荧光共聚焦透射电镜可以观察到在水稻或其它植物细胞中与荧光蛋白融合表达的OsRLCK5蛋白在植物细胞中的迁移及定位，明确该基因在细胞中的作用部位；还可利用此OsRLCK5基因编码的蛋白为诱饵蛋白钓出水稻或其它植株中与该蛋白互作的蛋白，明确该基因在抗纹枯病过程中的调控模式。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过对水稻类受体激酶OsRLCK5基因的克隆及其抗纹枯病功能分析，有助于解析水稻抗纹枯病的分子机制。在实践上可以通过转基因手段利用该基因培育抗纹枯病水稻材料，进一步通过品种间杂交，获得性状稳定的抗纹枯病水稻品种，有效控制纹枯病的发生，提高水稻产量。附图说明图1为OsRLCK5基因于纹枯病菌侵染的不同时间点在抗感水稻品种中的转录组表达模式；图2为OsRLCK5基因于纹枯病菌侵染的不同时间点在抗感水稻品种中的qRT-PCR验证表达模式；图3为OsRLCK5基因在转化植株中较野生型干扰株系中该基因的表达提高；图4为OsRLCK5基因在转化植株中较野生型干扰株系中该基因的表达降低；图5为水稻感纹枯病材料Lment、抗纹枯病材料特青、以感纹枯病材料Lment为背景过表达OsRLCK5基因植株和以抗纹枯病材料特青为背景干涉表达OsRLCK5基因植株接种纹枯病菌72h时的症状表型；图6为水稻感纹枯病材料Lment、抗纹枯病材料特青、以感纹枯病材料Lment为背景过表达OsRLCK5基因植株和以抗纹枯病材料特青为背景干涉表达OsRLCK5基因植株接种纹枯病菌72h时的病斑长统计。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。实施例一：水稻OsRLCK5基因cDNA的克隆及其序列分析将水稻特青种子于37℃下催芽1天后，播种于温室中，取三叶期水稻叶片提取RNA。提取方法采用Trizol法，具体操作步骤如下：(1)取50～100mg新鲜水稻叶片，放入事先准备好的的研钵(DEPC水浸泡24h，高温灭菌)中，加入适量液氮冷冻研磨成粉末状；(2)将研磨后的粉末移入事先准备好的无酶的1.5mlEP管，立即加入1ml的Trizol试剂，注意样品总体积不超过Trizol体积的10％；(3)将EP管冰浴15min后，加入400μL体积的氯仿，涡旋1min后，冰浴15min；(4)4℃条件下，12000rpm离心15min，小心吸取450μL体积的上清液至对位的无酶1.5mlEP管；(5)加入500μL体积的异丙醇，混合均匀；放入-20℃冰箱中，冷冻沉淀不少于30min；(6)冷冻沉淀结束后，4℃条件下，13000rpm离心20min，沉淀即为RNA；(7)离心结束后，倒掉上部液体，注意勿将RNA倒出；加入1ml75％乙醇(750μL的无水乙醇和250μL的DEPC水混合物)，室温条件下反复洗涤沉淀2～3次，每次5～10min；每次洗涤结束后，4℃条件下，7500rpm离心5min；(8)洗涤结束后高速瞬时离心，用小枪头把多余的酒精吸掉；(9)自然风干，使酒精挥发，根据实验要求加入适量的DEPC水，放置于-80℃冰箱保存备用；将获得的RNA通过反转录获得cDNA，反转录采用Y0Y0B0公司的ReverTraAceqPCRRTMasterMixwithgDNARemover试剂盒进行，具体操作如下：取lugRNA和适量双蒸水混匀，总体积为12ul，65℃处理5min，冰上迅速冷却后，加入4xDNaseMix4ul，37℃处理5min；加入5xRTMasterMix4ul，37℃处理15min后，再于50℃处理5min，98℃处理5min，终止反应。以日本晴基因组为模板设计引物OsRL1，序列如下：OsRL1-F：5'-ATGCGAGTAATTTATGTCTTGTGTG-3'(SEQIDNo.2)；OsRL1-R：5'-TCACTCATCCTCCTCTAAGATTTCA-3'(SEQIDNo.3)。以反转录获得的cDNA为模板扩增，采用RT-PCR法克隆水稻特青的OsRSb2基因，具体反应体系如下：2×PhantaMaxBuffer25μL、dNTPMix(10mMeach)1μL、上游引物(10μm)2μL、下游引物(10μm)2μL、PhantaMaxSuper-FidelityDNAPo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻胞质激酶编码基因OsRLCK5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种水稻胞质激酶编码基因OsRLCK5，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.含有权利要求1所述水稻胞质激酶编码基因OsRLCK5...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑爱萍，李平，王爱军，舒新月，张金锋，梁越洋，王玲霞，朱军，李双成，邓其明，刘怀年，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51