新方法技术

本发明专利技术提供了组合物、方法和过程，其用于包含脂质、甾醇和皂苷的亚微米脂质体组合物的熟化。

New method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新方法
本专利技术涉及用于生产含有皂苷的脂质体组合物，特别是这种组合物的过滤的改进方法。专利技术背景在过去几十年中，脂质体(也被称为双层脂质囊泡)越来越多地用来包封(encapsulate)和递送药物化合物。脂质体包含一个或多个脂质(诸如磷脂)双层，并且在其结构中可以含有其它分子，例如蛋白质或碳水化合物。脂质体上的脂质层限制和保护所包封(enclosed)的药物化合物直至脂质体到达其目的地并粘附到靶细胞的外膜。通过该过程，对健康细胞的药物毒性被最小化并可增加治疗效力。由于在其结构中存在脂质和水相，除两亲性化合物外，脂质体还可用于包封或包载(entrapment)水溶性和脂溶性物质。脂质体可用于佐剂组合物的配制中的疫苗/免疫原性组合物中。由于这些佐剂组合物通常经胃肠外施用给人，因此希望这些是无菌的。用作佐剂的脂质体通常是亚微米脂质体，并且足够小以通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。本专利技术的一个目的是提供用于亚微米脂质体的改进的过滤的方法。专利技术概述本专利技术人使用涉及使亚微米脂质体制剂熟化的方法改进了含有皂苷的亚微米脂质体的过滤。因此，本专利技术提供了制备在亚微米脂质体制剂中包含皂苷的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：a.制备第一亚微米脂质体制剂，其中脂质体含有脂质和甾醇，b.将皂苷加入第一亚微米脂质体制剂中，c.使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16小时，和，d.通过无菌级过滤器过滤步骤c.的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。在另一方面，本专利技术提供了制备在亚微米脂质体制剂中包含皂苷的脂质体组合物的方法，其中脂质体含有脂质和甾醇，所述方法包括以下步骤：a)使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、或至少16小时，其中脂质体含有脂质和甾醇，和，b)通过无菌级过滤器过滤步骤a)的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。在另一方面，本专利技术提供了制备疫苗组合物的方法，所述方法包括根据本文所述的方法制备脂质体组合物，其中在该方法的步骤d.的过滤之前或之后将脂质体组合物与抗原组合。一种用于制备疫苗试剂盒的方法，所述方法包括根据本文所述的方法制备脂质体组合物和将脂质体组合物包装进试剂盒中作为抗原试剂盒组分之外的试剂盒组分。附图的描述图1：图解了实施例2和3的含有皂苷的脂质体制剂的配制的流程图。图2：图解了使用不同的过滤器过滤前Vmax与时间函数的关系：Sartopore20.45/02；Sartopore20.35/0.2；Sartopore20.8/0.2；PallEKV；PallEDF。图3：图解了在实施例3的不同熟化时间，含有皂苷的脂质体制剂批次1(A)和批次2(B)的粒径(nm)的演变。图4：图解了在实施例3的不同熟化时间，含有皂苷的脂质体制剂批次1(A)和批次2(B)的PDI的演变。图5：图解了在实施例3的不同熟化时间，含有皂苷的脂质体制剂批次1(A)和批次2(B)在三个不同批次的过滤器上的Vmax。图6：图解了在实施例3的不同熟化时间，含有皂苷的脂质体制剂批次1(A)和批次2(B)在三个不同批次的过滤器上过滤之前和之后的胆固醇含量(μg/ml)。专利技术详述脂质体，特别是亚微米脂质体可用于免疫佐剂的配制中。包含所述脂质体与一种或多种抗原的组合的疫苗组合物通常肠胃外施用，因此脂质体组合物合乎需要地是无菌的。本专利技术人令人惊讶地显示，熟化步骤(如下一部分所定义)解决/避免了脂质体过滤中的问题，例如过滤器的堵塞。因此，本专利技术提供了制备在亚微米脂质体制剂中包含皂苷的组合物的方法，其中脂质体含有脂质和甾醇，所述方法包括以下步骤：a.制备第一亚微米脂质体制剂，其中脂质体含有脂质和甾醇，b.将皂苷加入第一亚微米脂质体制剂中，c.使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或至少16小时，和，d.通过无菌级过滤器过滤步骤c.的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。熟化“熟化(maturation)”或“熟化(maturing)”是指在将皂苷加入第一亚微米脂质体组合物后将含有皂苷的亚微米脂质体组合物储存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或至少16小时。在一个实施方案中，熟化持续至少4小时，至少6小时或至少8小时。在一个实施方案中，将应用或进行熟化不长于36小时，不长于48小时，或不长于24小时。在另一个实施方案中，应用熟化4-24小时的时间。在进一步的实施方案中，应用或进行熟化16-24小时。熟化可以在任何合适的容器中进行。在一个实施方案中，在不搅拌制剂的情况下进行熟化。在制剂经历一个或多个熟化(maturation)或熟化(maturing)步骤后，可将其描述为“熟化的”。熟化在任何合适的温度下进行。通常，熟化在室温下，在15-30℃的温度下，或在15-25℃的温度下进行。或者，熟化在约18、19、20、21、22、23、24、25、26或27℃下进行。在一个实施方案中，熟化在15-25℃的温度下进行8-24小时的时段。灭菌“无菌级过滤器”是指在大于或等于1×107/cm2的有效过滤面积的攻击水平下被微生物攻击后产生无菌流出物的过滤器。无菌级过滤器对于本专利
的技术人员来说是公知的，并且通常具有约0.2μm的孔径，并因此包括孔径为约0.22μm的过滤器。出于本专利技术的目的，无菌级过滤器的孔径为0.1-0.25μm，例如0.18-0.22μm。无菌级过滤器的膜可以由技术人员已知的任何合适的材料制成，例如但不限于乙酸纤维素、聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)等。在本专利技术的一个特定实施方案中，本专利技术的一种或多种或所有过滤膜包含聚醚砜(PES)，特别是亲水性聚醚砜。在本专利技术的一个特定实施方案中，本文所述方法中使用的过滤器是双层过滤器，特别是具有内置预过滤器的无菌过滤器，所述内置预过滤器具有比末端过滤器的孔径更大的孔径。在一个实施方案中，消毒过滤器是双层过滤器，其中预过滤膜层的孔径为0.3-0.5μm，例如0.35或0.45μm。根据进一步的实施方案，过滤器包含不对称过滤膜（多张），例如不对称亲水性PES过滤膜（多张）。或者，消毒过滤层可以由PVDF制成，例如与不对称亲水性PES预过滤膜层组合。脂质体术语“脂质体”是本领域众所周知的并定义一般类别的囊泡，其包含一个或多个围绕水空间的脂质双层。因此脂质体由一种或多种脂质，例如磷脂双层组成，并且在其结构中可以含有其它分子，例如蛋白质或碳水化合物。因为存在脂质和水相，脂质体可以包封或包载水溶性物质、脂溶性物质和/或两亲性化合物。意图用于本专利技术的脂质体含有大量(脂质体形成)脂质。脂质体形成脂质是本领域可获得的，并且可以是阴离子、阳离子或中性脂质。在一个实施方案中，脂质体形成脂质部分基本上由中性脂质组成。“中性脂质”应理解为脂质的总净电荷为(大约)零。因此，脂质可以是总体上非离子的或者可以是两性离子的。在一个实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备脂质体组合物的方法，所述脂质体组合物在亚微米脂质体制剂中包含皂苷，其中所述脂质体含有脂质和甾醇，所述方法包括以下步骤:a) 制备第一亚微米脂质体制剂，其中脂质体含有脂质和甾醇，b) 将皂苷加入第一亚微米脂质体制剂中，c) 使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16小时，和，d) 通过无菌级过滤器过滤步骤c)的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.07 GB 1620758.1;2017.06.01 GB 1708734.71.一种制备脂质体组合物的方法，所述脂质体组合物在亚微米脂质体制剂中包含皂苷，其中所述脂质体含有脂质和甾醇，所述方法包括以下步骤:a)制备第一亚微米脂质体制剂，其中脂质体含有脂质和甾醇，b)将皂苷加入第一亚微米脂质体制剂中，c)使含有皂苷的亚微米脂质体制剂熟化至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16小时，和，d)通过无菌级过滤器过滤步骤c)的熟化的含有皂苷的亚微米脂质体制剂。2.根据权利要求1的方法，其中所述第一亚微米脂质体制剂还含有TLR-4激动剂。3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质是中性脂质。4.根据权利要求3的方法，其中所述中性脂质是选自蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱的磷脂酰胆碱。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述中性脂质是DOPC。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述甾醇是胆固醇。7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中脂质与甾醇的比率为3:1至5:1，例如约4:1。8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述皂苷是QS21。9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述TLR-4激动剂是脂多糖。10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述TLR-4激动剂是3D-MPL。11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质体制剂在5-7，例如在6.1的pH下缓冲。12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤d)的过滤后的脂质体具有80-120nm的Z-平均直径。13.根据前述权利要求中任一项的方法，还包括通过另外的无菌级过滤器过滤步骤d)的亚微米脂质体制剂的步骤e)。14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法还包括向步骤a)的亚微米脂质体制剂中加入缓冲剂的步骤。15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤d)的过滤在15-25℃的温度下进行。16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)的熟化在低于15℃的温度下，例如在2-8℃进行，并且步骤d)的过滤在15℃-25℃的温度下进行。17.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：P卡拉，VMR亨德里克斯，VM德库佩雷，CBG德克泽尔，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE