一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法技术

本发明专利技术公开了一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法，具体涉及临床医学中的抗膀胱癌的联合治疗领域，包括细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法以及体内BCG对表柔比星的增效作用的方法。本发明专利技术通过使用细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法以及体内BCG对表柔比星的增效作用的方法，提供了一种联合用药的方案，以提高治疗效率，降低药物灌注时的毒副作用，本发明专利技术灌注药物浓度不高，但是膀胱内保持时间长，从而抗肿瘤效果越好，并且不会发生不良反应。

A method of BCG promoting epirubicin in the treatment of bladder cancer

The invention discloses a method of BCG promoting epirubicin in the treatment of bladder cancer, which specifically relates to the field of combined therapy of anti-bladder cancer in clinical medicine, including the method of studying the synergistic effect of BCG on epirubicin at the cellular level and the method of synergistic effect of BCG on epirubicin vivo. The invention provides a scheme of combined medication by using the method of studying the synergistic effect of BCG on epirubicin at the cellular level and the synergistic effect of BCG on epirubicin in vivo, so as to improve the therapeutic efficiency and reduce the toxic and side effects of drug perfusion. The perfusion concentration of the invention is not high, but the retention time in the bladder is long, so the anti-tumor effect is better, and not. Adverse reactions may occur.

【技术实现步骤摘要】
一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法
本专利技术涉及临床医学中的抗膀胱癌的联合治疗
，更具体地说，本专利技术涉及一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法。
技术介绍
膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，每年新增五万以上的病例。其中90％以上来源于膀胱黏膜移行上皮细胞，5-10％为鳞癌，2-3％为腺癌。治疗方法多采用经尿道切除术(TUR)彻底切除肉眼可见肿瘤，并辅以辅助性灌注治疗来预防肿瘤的复发与进展。据统计，膀胱癌患者中，75-85％的膀胱癌为浅表性癌，50-80％的浅表性癌在术后1年后将复发，10-30％的复发肿瘤而行程度增加。术后通过灌注治疗，可有效减少肿瘤的复发与进展，提高生活质量。应用化疗药物(细胞毒性药物)或免疫制剂进行膀胱灌注是当前治疗早期浅表性膀胱肿瘤、预防膀胱癌术后复发的最常用方法，但药物种类繁多，灌注方法不一，治疗效果也相同。一般认为灌注药物浓度越高，膀胱内保持时间越长，抗肿瘤效果越好，但不良反应也越大，选择适当的药物，合理的灌注剂量和方法显得至关重要。与本专利技术相关的现有技术：灌注主要用药种类包括：卡介苗(BCG)、干扰素、表柔比星、吡柔比星、羟基喜树碱、5-氟尿嘧啶等。卡介苗灌注方法为：常温下，120mgBCG冻干粉溶于40-60ml生理盐水中膀胱内灌注，保留2小时。一般术后2周开始灌注，每周一次，连续6次后改为每月1次，持续2年以上。表柔比星术后6小时内首次单次膀胱灌注80mg，以后每月一次50mg，膀胱内维持60min，维持8-10个月。上述药物灌注对肿瘤的作用机理不同，且均采用单一用药方式灌注，联合应用是否具有更好的效果，目前尚未有联合灌注的应用与报道。并且这些方法由于药物的副作用，具有一定的缺陷，只能在药物剂量与效应之间采取平衡。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的实施例提供一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法，通过使用细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法以及体内BCG对表柔比星的增效作用的方法，提供了一种联合用药的方案，以提高治疗效率，降低药物灌注时的毒副作用，本专利技术灌注药物浓度不高，但是膀胱内保持时间长，从而抗肿瘤效果越好，并且不会发生不良反应。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法，包括细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法以及体内BCG对表柔比星的增效作用的方法；本专利技术提供了细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法，具体步骤如下：步骤一、细胞培养：在37℃、5％CO2条件下采用含有10％胎牛血清的MEM培养基进行培养，每隔2-3天换液或传代；步骤二、细胞活性检测：使用CCK8细胞活性检测试剂盒收集对数期人膀胱癌UMUC3细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，按每孔100μL接种于96孔板中，放置于培养箱过夜；步骤三、待细胞贴壁后，根据不同浓度加入相应药物，达到预设时间后，弃去旧培养基并用PBS洗2遍；步骤四、使用CCK8检测细胞活性：每孔加入含有10％CCK8的MEM培养基100μL，于37℃孵育4小时后于450nm处读取吸光度值(OD)，再根据OD值进行计算，检测药物对细胞的活性影响；本专利技术还提供了体内BCG对表柔比星的增效作用的方法，具体步骤如下：步骤一、选材：选取SPF级雌性SD大鼠106只，体重为180g-200g，随机分为造模组(10只)、空白对照组(24只)、EPI组(24只)、EPI+BCG组(24只)和EPI+CpG组(24只)；准备主要试剂：枸橼酸、MNU试剂、水合氯醛、4％多聚甲醛固定液、大鼠白介素2(IL-2)酶联免疫分析测定试剂盒、表柔比星、卡介苗、CpG-ODN、CpG-ODN序列；准备主要仪器和设备：调速型迷你离心机、HWS26型电热恒温水浴锅、电热恒温培养箱、酶标仪、倒置显微镜、AR-1000电子天平和切片机；步骤二、开始实验：1)建立大鼠原位膀胱癌模型：a.将SD大鼠进行1周的适应性喂养，灌注前大鼠禁食禁水12h，尽可能排空膀胱内的尿液；b.灌注实验所用MNU试剂在实验前一天放置于4℃冰箱过夜，临用前以pH6.0的枸橼酸缓冲液为溶剂，取MNU试剂配成浓20mg/ml，在40min内使用完毕；c.大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定，75％乙醇消毒尿道外口2次；d.将1.0mm规格的一次性硬膜外导管抹无菌石蜡油后对准大鼠尿道口缓慢插入，将准备好的MNU溶液0.1ml经注射管灌入膀胱内，退出硬膜导管后随即将尿道口用小金属静脉夹夹闭，溶液滞留60min；e.大鼠进行膀胱灌注MNU，每次2mg，每2周1次，共4次，灌注时间为第1、3、5和7周，第8周模型建立完成，此时大鼠为本次研究的对象,饲养在温度22-26℃，湿度20-70％的SPF级别环境中,每天观察大鼠精神状态、进食饮水情况，有无肉眼血尿；2)建模后灌注给药浓度控制：除造模组为10只大鼠，其他组别每组24只大鼠，建模后1周用药，每次灌注0.1ml，灌注时间为第9、11、13和15周，在此灌注给药期间：造模组，无任何处理；对照组，灌注生理盐水；表柔比星组，灌注EPI(2mg/ml)；表柔比星+卡介苗组，灌注EPI+BCG(2mg/ml+2mg/ml)；表柔比星+CpGODN组，灌注EPI+CpGODN(2mg/ml+4μM/ml)；3)样本采集：a.血清采集，于每次灌药后1周，通过眼眶采血法收集全血标本于血清分离管中放置4℃过夜，然后3000r/min离心15分钟，取上清即可，做好相应标记置于-20℃保存，且不超过1个月，避免反复冻融，每次各组收集6只大鼠；b.膀胱组织采集，于每次灌药后1周，采用拉脱颈椎法处死大鼠，每组各6组；剖腹，将其膀胱完整切除，观察膀胱内表面及癌形成的大体情况并拍照，置于冻存管中，做好相应标记置于-80℃保存；标本采集时间为，第2、4、6、8、10、12、14、16周；4)使用ELISA法测定步骤六采集的血清中IL2含量；5)使用HE染色法观察病理变化：将各组膀胱组织置于4％多聚甲醛溶液中固定15-24小时，固定时间视环境温度而异；然后常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色，在显微镜下观察病理变化；6)使用免疫组化法检测组织切片中p53的表达，抗体工作液浓度均为1：100；步骤三、统计学分析：使用SPSS19.0统计软件进行分析，计算数据以平均数±标准差表示，采用单因素方差分析各组的IL-2浓度的差异，P＜0.05表示差异有显著性；步骤四、p53免疫组化结果判断：阳性染色细胞数＜10％为(－)，阳性染色细胞数10％～25％为(+)，阳性染色细胞数25％～75％为(++)。阳性染色细胞数≥75％为(+++)；步骤五、观察实验结果：1)观察各组SD大鼠的膀胱癌发病率情况，比较对照组与造模组大鼠膀胱癌的发生率差异有显著性,说明MNU诱发膀胱癌大鼠有明显作用，并在各治疗组膀胱癌形成后分别按照给药浓度治疗，详见表1；2)使用ELISA法检测大鼠血清中IL-2含量的变化，三次灌注治疗，进行IL-2浓度比较；3)肉眼观察，通过肉眼观察膀胱癌造模组大鼠的膀胱特征；4)HE染色切片分析，处死大鼠，取膀胱组织依次通过苏木精-伊红(HE)染色，置显微镜下观察病理变化；5)使用免疫组化法检测组织切片中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法，其特征在于：包括细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法以及体内BCG对表柔比星的增效作用的方法；其中，细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法，具体步骤如下：步骤一、细胞培养：在37℃、5％CO2条件下采用含有10％胎牛血清的MEM培养基进行培养，每隔2‑3天换液或传代；步骤二、细胞活性检测：使用CCK8细胞活性检测试剂盒收集对数期人膀胱癌UMUC3细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，按每孔100μL接种于96孔板中，放置于培养箱过夜；步骤三、待细胞贴壁后，根据不同浓度加入相应药物，达到预设时间后，弃去旧培养基并用PBS洗2遍；步骤四、使用CCK8检测细胞活性：每孔加入含有10％CCK8的MEM培养基100μL，于37℃孵育4小时后于450nm处读取吸光度值(OD)，再根据OD值进行计算，检测药物对细胞的活性影响；另外，体内BCG对表柔比星的增效作用的方法，具体步骤如下：步骤一、选材：选取SPF级雌性SD大鼠106只，体重为180g‑200g，随机分为造模组(10只)、空白对照组(24只)、EPI组(24只)、EPI+BCG组(24只)和EPI+CpG组(24只)；准备主要试剂：枸橼酸、MNU试剂、水合氯醛、4％多聚甲醛固定液、大鼠白介素2(IL‑2)酶联免疫分析测定试剂盒、表柔比星、卡介苗、CpG‑ODN、CpG‑ODN序列；准备主要仪器和设备：调速型迷你离心机、HWS26型电热恒温水浴锅、电热恒温培养箱、酶标仪、倒置显微镜、AR‑1000电子天平和切片机；步骤二、开始实验：1)建立大鼠原位膀胱癌模型：a.将SD大鼠进行1周的适应性喂养，灌注前大鼠禁食禁水12h，尽可能排空膀胱内的尿液；b.灌注实验所用MNU试剂在实验前一天放置于4℃冰箱过夜，临用前以pH6.0的枸橼酸缓冲液为溶剂，取MNU试剂配成浓20mg/ml，在40min内使用完毕；c.大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定，75％乙醇消毒尿道外口2次；d.将1.0mm规格的一次性硬膜外导管抹无菌石蜡油后对准大鼠尿道口缓慢插入，将准备好的MNU溶液0.1ml经注射管灌入膀胱内，退出硬膜导管后随即将尿道口用小金属静脉夹夹闭，溶液滞留60min；e.大鼠进行膀胱灌注MNU，每次2mg，每2周1次，共4次，灌注时间为第1、3、5和7周，第8周模型建立完成，此时大鼠为本次研究的对象,饲养在温度22‑26℃，湿度20‑70％的SPF级别环境中,每天观察大鼠精神状态、进食饮水情况，有无肉眼血尿；2)建模后灌注给药浓度控制：除造模组为10只大鼠，其他组别每组24只大鼠，建模后1周用药，每次灌注0.1ml，灌注时间为第9、11、13和15周，在此灌注给药期间：造模组，无任何处理；对照组，灌注生理盐水；表柔比星组，灌注EPI(2mg/ml)；表柔比星+卡介苗组，灌注EPI+BCG(2mg/ml+2mg/ml)；表柔比星+CpG ODN组，灌注EPI+CpG ODN(2mg/ml+4μM/ml)；3)样本采集：a.血清采集，于每次灌药后1周，通过眼眶采血法收集全血标本于血清分离管中放置4℃过夜，然后3000r/min离心15分钟，取上清即可，做好相应标记置于‑20℃保存，且不超过1个月，避免反复冻融，每次各组收集6只大鼠；b.膀胱组织采集，于每次灌药后1周，采用拉脱颈椎法处死大鼠，每组各6组；剖腹，将其膀胱完整切除，观察膀胱内表面及癌形成的大体情况并拍照，置于冻存管中，做好相应标记置于‑80℃保存；标本采集时间为，第2、4、6、8、10、12、14、16周；4)使用ELISA法测定步骤六采集的血清中IL2含量；5)使用HE染色法观察病理变化：将各组膀胱组织置于4％多聚甲醛溶液中固定15‑24小时，固定时间视环境温度而异；然后常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色，在显微镜下观察病理变化；6)使用免疫组化法检测组织切片中p53的表达，抗体工作液浓度均为1：100；步骤三、统计学分析：使用SPSS19.0统计软件进行分析，计算数据以平均数±标准差...

【技术特征摘要】
1.一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法，其特征在于：包括细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法以及体内BCG对表柔比星的增效作用的方法；其中，细胞水平研究BCG对表柔比星的增效作用的方法，具体步骤如下：步骤一、细胞培养：在37℃、5％CO2条件下采用含有10％胎牛血清的MEM培养基进行培养，每隔2-3天换液或传代；步骤二、细胞活性检测：使用CCK8细胞活性检测试剂盒收集对数期人膀胱癌UMUC3细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，按每孔100μL接种于96孔板中，放置于培养箱过夜；步骤三、待细胞贴壁后，根据不同浓度加入相应药物，达到预设时间后，弃去旧培养基并用PBS洗2遍；步骤四、使用CCK8检测细胞活性：每孔加入含有10％CCK8的MEM培养基100μL，于37℃孵育4小时后于450nm处读取吸光度值(OD)，再根据OD值进行计算，检测药物对细胞的活性影响；另外，体内BCG对表柔比星的增效作用的方法，具体步骤如下：步骤一、选材：选取SPF级雌性SD大鼠106只，体重为180g-200g，随机分为造模组(10只)、空白对照组(24只)、EPI组(24只)、EPI+BCG组(24只)和EPI+CpG组(24只)；准备主要试剂：枸橼酸、MNU试剂、水合氯醛、4％多聚甲醛固定液、大鼠白介素2(IL-2)酶联免疫分析测定试剂盒、表柔比星、卡介苗、CpG-ODN、CpG-ODN序列；准备主要仪器和设备：调速型迷你离心机、HWS26型电热恒温水浴锅、电热恒温培养箱、酶标仪、倒置显微镜、AR-1000电子天平和切片机；步骤二、开始实验：1)建立大鼠原位膀胱癌模型：a.将SD大鼠进行1周的适应性喂养，灌注前大鼠禁食禁水12h，尽可能排空膀胱内的尿液；b.灌注实验所用MNU试剂在实验前一天放置于4℃冰箱过夜，临用前以pH6.0的枸橼酸缓冲液为溶剂，取MNU试剂配成浓20mg/ml，在40min内使用完毕；c.大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定，75％乙醇消毒尿道外口2次；d.将1.0mm规格的一次性硬膜外导管抹无菌石蜡油后对准大鼠尿道口缓慢插入，将准备好的MNU溶液0.1ml经注射管灌入膀胱内，退出硬膜导管后随即将尿道口用小金属静脉夹夹闭，溶液滞留60min；e.大鼠进行膀胱灌注MNU，每次2mg，每2周1次，共4次，灌注时间为第1、3、5和7周，第8周模型建立完成，此时大鼠为本次研究的对象,饲养在温度22-26℃，湿度20-70％的SPF级别环境中,每天观察大鼠精神状态、进食饮水情况，有无肉眼血尿；2)建模后灌注给药浓度控制：除造模组为10只大鼠，其他组别每组24只大鼠，建模后1周用药，每次灌注0.1ml，灌注时间为第9、11、13和15周，在此灌注给药期间：造模组，无任何处理；对照组，灌注生理盐水；表柔比星组，灌注EPI(2mg/ml)；表柔比星+卡介苗组，灌注EPI+BCG(2mg/ml+2mg/ml)；表柔比星+CpGODN组，灌注EPI+CpGODN(2mg/ml+4μM/ml)；3)样本采集：a.血清采集，于每次灌药后1周，通过眼眶采血法收集全血标本于血清分离管中放置4℃过夜，然后3000r/min离心15分钟，取上清即可，做好相应标记置于-20℃保存，且不超过1个月，避免反复冻融，每次各组收集6只大鼠；b.膀胱组织采集，于每次灌药后1周，采用拉脱颈椎法处死大鼠，每组各6组；剖腹，将其膀胱完整切除，观察膀胱内表面及癌形成的大体情况并拍照，置于冻存管中，做好相应标记置于-80℃保存；标本采集时间为，第2、4、6、8、10、12、14、16周；4)使用ELISA法测定步骤六采集的血清中IL2含量；5)使用HE染色法观察病理变化：将各组膀胱组织置于4％多聚甲醛溶液中固定15-24小时，固定时间视环境温度而异；然后常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色，在显微镜下观察病理变化；6)使用免疫组化法检测组织切片中p53的表达，抗体工作液浓度均为1：100；步骤三、统计学分析：使用SPSS19.0统计软件进行分析，计算数据以平均数±标准差表示，采用单因素方差分析各组的IL-2浓度的差异，P＜0.05表示差异有显著性；步骤四、p53免疫组化结果判断：阳性染色细胞数＜10％为(－)，阳性染色细胞数10％～25％为(+)，阳性染色细胞数25％～75％为(++)。阳性染色细胞数≥75％为(+++)；步骤五、观察实验结果：1)观察各组SD大鼠的膀胱癌发病率情况，比较对照组与造模组大鼠膀胱癌的发生率差异有显著性,说明MNU诱发膀胱癌大鼠有明显作用，并在各治疗组膀胱癌形成后分别按照给药浓度治疗，详见表1；2)使用ELISA法检测大鼠血清中IL-2含量的变化，三次灌注治疗，进行IL-2浓度比较；3)肉眼观察，通过肉眼观察膀胱癌造模组大鼠的膀胱特征；4)HE染色切片分析，处死大鼠，取膀胱组织依次通过苏木精-伊红(HE)染色，置显微镜下观察病理变化；5)使用免疫组化法检测组织切片中p53表达，所有染色切片均在光学显微镜下观察，用计算机图像分析系统扫描拍照后保存，阳性细胞技术采用图像分析软件统计计算，p53阳性着色位于肿瘤细胞核内，细胞核被染成棕褐色，每张切片随机取5个高倍视野(400×)，计数阳性细胞数，以阳性细胞数占整个观察视野的细胞数为百分比；将同一批染色切片，用图像分析软件进行肿瘤细胞灰度统计计算。2.根据权利要求1所述的一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法，其特征在于：所述体内BCG对表柔比星的增效作用的方法中，CpG-ODN序列包含72个碱基，且全部序列被硫代磷酸修饰。3.根据权利要求1所述的一种卡介苗促进表阿霉素治疗膀胱癌的方法，其特征在于：所述体内BCG对表柔比星的增效作用的方法中，膀胱癌评判标准如下：a.未见异常：黏膜上皮层次清楚，排列规则，细胞形态、大小、染色一致；b.轻度不典型增生：膀胱粘膜，乳头呈圆锥形，细胞排列一致，无异形性；c.重度不典型增生：细胞大小不一，排列紊乱，极向紊乱，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟民杰，董斌，田素娟，骆阳，傅晓仪，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44