一种可诱导表达的Sympk支架蛋白促进干细胞增殖的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种干细胞的培养方法及应用，还提供了一种Sympk支架蛋白促进干细胞增殖的方法及应用。其中，所述干细胞的培养方法包括：1)将Sympk的基因编码序列克隆到表达载体，获得重组表达载体；2)将重组表达载体转染细胞，获得可诱导性表达Sympk支架蛋白的细胞；3)诱导Sympk支架蛋白表达；4)传代培养获得干细胞。本发明专利技术提供的Sympk支架蛋白是一种高等生物体内广泛存在的保守蛋白，在体外培养细胞过程中通过诱导Sympk支架蛋白的表达可促进干细胞的增殖，不影响其分化潜能，且不会形成胚癌细胞。

A method of inducible expression of Sympk scaffold protein promoting stem cell proliferation and its application

【技术实现步骤摘要】
一种可诱导表达的Sympk支架蛋白促进干细胞增殖的方法及应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种可诱导表达的Sympk支架蛋白，促进干细胞的增殖并保持自我更新和多能性的方法及应用。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。胚胎干细胞具有广泛的自我更新能力并具有分化为所有三种胚层细胞的多能性潜能，可用于治疗目的，并且可为组织移植治疗、药物筛选、功能基因组学和蛋白质组学提供无限的细胞来源。干细胞移植治疗是一门先进的医学技术，为一些疑难杂症的治疗带来了希望。干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的的医疗手段。干细胞移植治疗范围很广，对很多传统医疗手段无法治愈的神经系统性疾病例如神经退行型疾病，脑瘫和免疫系统性疾病如急性白血病、血管病变以及其它疾病都具有很好的治疗效果的潜能。干细胞移植治疗的优点在于其低毒性、安全、无免疫排斥反应且来源充足；但是来源于病人的干细胞如何在体外高产量和高质量的扩增以及缩短高花费的培养周期是临床医生所面临的难点。传统用于提高体外培养干细胞产量的方法有添加细胞生长因子，人工合成的小分子化合物，多聚赖氨酸包被培养皿等。然而有些干细胞，例如间充质干细胞对外源添加物的刺激很敏感，极其容易在培养的过程中产生复制性的凋亡，同时一些使用外源性添加物促进干细胞增殖的方法可能存在缺陷，即在刺激干细胞增殖的同时影响了干细胞多能性的维持。因此，有必要提供一种降低外源性添加物依赖、提高体外培养干细胞产量而又不影响干细胞自我更新和多能性维持的方法。Sympk蛋白即偶对蛋白，1996年在人的肠上皮细胞和睾丸支持细胞中发现，被认为是一个与细胞连接相关的蛋白。随后的研究发现Sympk蛋白在体细胞质多聚腺苷酸化中也具有重要作用。在多聚腺苷酸化过程中，需要多种蛋白复合体，包括切割-多聚腺苷酸化特异因子CPSF、切割活公因子CstF、切割因子I和II，多聚腺苷酸聚合酶PAP等。而Sympk作为一种脚手架蛋白介导并协调CPSF和CstF两者间的相互作用。目前暂未发现Sympk蛋白作为促进细胞增殖方面的相关报道。
技术实现思路
本专利技术公开了Sympk蛋白的新用途，发现Sympk支架蛋白具有促进体外培养的干细胞增殖的作用，使其能保持自我更新和多能性维持的能力，诱导Sympk支架蛋白的表达可以作为一个促进干细胞体外扩增的技术手段。本专利技术第一方面提供一种干细胞的培养方法，包括：1)将Sympk的基因编码序列克隆到表达载体，获得重组表达载体；2)将重组表达载体转染细胞，获得可诱导性表达Sympk支架蛋白的细胞；3)诱导Sympk支架蛋白表达，所述的Sympk支架蛋白的诱导表达采用强力霉素诱导表达，其中，所述的强力霉素的诱导浓度为100-1000ng/ml；4)传代培养获得干细胞，其中，传代培养过程中重复步骤3)的诱导条件。在本专利技术一实施方式中，所述步骤1)中，所述Sympk基因序列为Sympk全长基因编码序列，所述Sympk基因全长编码序列是由CD1小鼠睾丸的cDNA作为模板，通过特异性引物进行PCR获得。在本专利技术一实施方式中，所述CD1小鼠睾丸的cDNA在GENEBANK上的登录号为：GeneID:68188。在本专利技术一实施方式中，所述特异性引物的上、下游序列分别为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。在本专利技术一实施方式中，所述传代培养传代1-12代。优选地培养至第10代。在本专利技术一实施方式中，所述传代培养传代第10代，传代培养的第11代和第12代细胞采用去除强力霉素诱导的培养基。需要说明的是，本领域技术人员可以根据具体实际需求，决定传代的次数，比如30代或50代或更多，且获得本专利技术实施例传代培养传代1-12代的等同的技术效果，应纳入本专利技术保护范围。在本专利技术一实施方式中，所述步骤2)中，所述重组表达载体包括G418抗生素筛选标记，获得可诱导性表达Sympk支架蛋白的细胞的步骤还包括：采用G418抗生素抗性筛选Sympk支架蛋白表达的细胞。本领域技术人员可以理解的是，本专利技术所述的强力霉素的诱导浓度为细胞培养基中强力霉素的终浓度。可以理解的是，本领域技术人员选择其他常规使用的强力霉素衍生物或类似物诱导表达试剂，比如四环霉素，来替换本专利技术实施例采用的强力霉素，应纳入本专利技术保护范围。在本专利技术一实施方式中，所述步骤3)中，所述的诱导Sympk支架蛋白表达过程中，细胞培养基中强力霉素的终浓度为500-1000ng/ml。在本专利技术一实施方式中，所述4)中，所述的传代培养过程中，细胞培养基中强力霉素的终浓度为100-1000ng/m。优选为500-1000ng/m。在本专利技术一实施方式中，所述方法促进干细胞增殖，且不影响干细胞多能性。在本专利技术一实施方式中，所述方法不影响胚层标记物的表达。进一步的，所述方法不影响胚层标记物的表达中，所述的胚层标记物包括Foxa2、Gata6、Sox17、Gata4、Mash1、Nestin、Goosecoid、branchyury、Hand1、Eomes中的一种或多种。更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述胚层标记物的mRNA水平变化为0％-10％，优选为0-5％、进一步优选为0-3％、更进一步优选为0-1％。更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述内胚层标记物Foxa2和Sox17的mRNA水平变化为0％-2％。更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述内胚层标记物Foxa2和Sox17的mRNA水平变化为0％-2％。更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述中胚层标志物Goosecoid和Brachyury的mRNA水平变化为0％-3％。更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述中胚层标志物外胚层标志物Nestin1和Mash1的mRNA水平变化为0％-1％更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述滋养外胚层标志物Hand1和Eomes相对于对照组mRNA水平的变化为0-7％。在本专利技术一实施方式中，所述步骤3)中，所述强力霉素诱导表达还包括采用辅助载体与重组表达载体共转染细胞，所述的表达载体为3×Flag-p2loxp载体或EGFP-p2loxp载体，所述的辅助载体为pSolk-Cre载体。优选地，所述步骤1)中，将Sympk基因序列克隆到表达载体3×Flag-p2loxp载体的EcoRV/NotI酶切位点之间。本领域技术人员可以根据具体需求，比如不同于Flag、EGFP的载体筛选标记，选择其他表达载体替换本专利技术实施例所采用的3×Flag-p2loxp载体或EGFP-p2loxp载体，且获得合理预期技术效果，本领域技术人员采用其他表达载体或辅助载体应纳入本专利技术保护范围。在本专利技术一实施方式中，所述干细胞为胚胎干细胞。更进一步地，所述细胞为小鼠胚胎干细胞。在本专利技术一实施方式中，在表达Sympk支架蛋白的细胞的克隆形成实验中，相较于未使用强力霉素诱导添加表达Sympk支架蛋白的干细胞，本专利技术第一方面所述的方法不改变干细胞克隆形成的数目。本专利技术第二方面提供由第一方面所述的干细胞培养方法制备得到的细胞。本专利技术第三方面提供了一种干细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞的培养方法，其特征在于，包括：1)将Sympk的基因编码序列克隆到表达载体，获得重组表达载体；2)将重组表达载体转染细胞，获得可诱导性表达Sympk支架蛋白的细胞；3)诱导Sympk支架蛋白表达，所述的Sympk支架蛋白的诱导表达采用强力霉素诱导表达，其中，所述的强力霉素的诱导浓度为100‑1000ng/ml；4)传代培养获得干细胞，其中，传代培养过程中重复步骤3)的诱导条件。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞的培养方法，其特征在于，包括：1)将Sympk的基因编码序列克隆到表达载体，获得重组表达载体；2)将重组表达载体转染细胞，获得可诱导性表达Sympk支架蛋白的细胞；3)诱导Sympk支架蛋白表达，所述的Sympk支架蛋白的诱导表达采用强力霉素诱导表达，其中，所述的强力霉素的诱导浓度为100-1000ng/ml；4)传代培养获得干细胞，其中，传代培养过程中重复步骤3)的诱导条件。2.如权利要求1所述的干细胞的培养方法，其特征在于，所述传代培养传代1-12代。3.如权利要求1所述的干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述重组表达载体包括G418抗生素筛选标记，获得可诱导性表达Sympk支架蛋白的细胞的步骤还包括：采用G418抗生素抗性筛选Sympk支架蛋白表达的细胞。4.如权利要求1所述的干细胞的培养方法，其特征在于，所述方法促进干细胞增殖，且不影响干细胞多能性。5.如权利要求1所述的干细胞的培养方法，其特征在于，所述方法不影响胚层标记物的表达。6.一种由权利要求1所述的干细胞培养方法制备得到的细胞。7.一种干细胞的培养试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄军就，俞建萍，马文宾，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44