人多能干细胞培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人多能干细胞培养基及其制备方法和应用，其中，所述细胞培养基含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素生长因子、bFGF、转铁蛋白和转化生长因子β信号通路抑制剂。实现了不含有动物源成分，并且能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，同时制备方法步骤简单、原料易得，且培养的细胞代次多，增殖能力强，状态好的效果。

Human pluripotent stem cell culture medium and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
人多能干细胞培养基及其制备方法和应用
本专利技术涉及培养基领域，具体地，涉及人多能干细胞培养基及其制备方法和应用。
技术介绍
干细胞是指能够自我更新、分裂以及分化成其它细胞类群的一种细胞。从干细胞在发育中所处的阶段来看，干细胞可以分为胚胎干细胞(embryonicstemceLL，ES细胞)和成体干细胞(aduLtstemceLL)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotentstemcell，TSC)、多能干细胞(pluripotentstemcell)和单能干细胞(unipotentstemcell)(专能干细胞)。胚胎干细胞是一种多能干细胞(pLuripotentstemceLL)，可以分化成人体两百多种类型细胞、形成机体的组织和器官，即能分化成多种细胞和组织的潜能的干细胞，并且可以无限增殖。1981年Evans和Kaufman从小鼠内细胞团(innerceLLmass，ICM)分离出胚胎干细胞，之后ES细胞研究成为各国科学家研究的热点，近年来围绕干细胞定向分化成其它类型细胞的研究如雨后春笋般出现(1981；Nature292(5819):154-6)。1998年Thomson成功分离、培养人类胚胎干细胞，为干细胞的人类医学应用提供了可能(1998；Science282(5391)：1145-7)。2006年日本京都大学的山中伸弥等率先报道了iPS细胞的研究(2006；CeLL126(4):663-76)，他们通过向终端分化的小鼠表皮成纤维细胞中导入四种转录因子OSKM(Oct4,Sox2,KLf4,c-Myc)，可以诱导终端分化的细胞成干细胞状态，即iPS细胞(inducedpLuripotentstemceLL)，此后出现了各种制造iPS细胞的技术路径。而山中博士亦因在细胞重编程领域的杰出贡献，获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。人工诱导的多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的分化能力、表观遗传修饰和细胞形态等其他特征，并且来源广泛，无道德伦理争议，为干细生物学领域和临床再生医学提供了新的研究方向。干细胞具有多种分化潜能，以及自我更新和无限增殖的潜力，并且可以在体外长期保存。干细胞的这些特点为科学研究和医学应用提供了很好的细胞来源。目前干细胞主要研究与应用方向主要包括：1)药物开发和药物筛选，体外诱导干细胞定向分化成特定类型细胞后加入各种药物，研究药物对特定组织或细胞的毒性，节省大量研究成本，为临床应用提供大量数据。2)细胞治疗，已有报道可以将干细胞定向分化成肝细胞(公告号为CN102666853A的专利)和心肌细胞(公告号为CN103602633A和CN104293730A的专利)等其他类型的细胞，为细胞治疗提供了大量的有生理功能的细胞来源；3)再生医学领域，传统再生医学如器官移植是通过供体者器官移植到受体体内，这种移植手段会产生很多问题，如免疫排斥反应和感染等。通过体外人工诱导病人自己的干细胞定向分化成成熟的具有生理功能的器官可以有效地解决这些负面效应，为再生医学提供新方法。目前，多能干细胞的培养过程中使用的培养基中往往含有动物源成分，尤其是中内胚层前体细胞的培养基，比如使用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞，MouseEmbryonicFibrobLast)滋养层细胞和培养基中的动物血清。虽然上述培养基可以保证干细胞及其诱导分化的细胞具有优异的自我更新能力，但是由于培养基中引入大量动物源性物质，给干细胞及其诱导分化的细胞自我更新及分化过程带来了不确定因素，增加了误差；同时可能引入动物源性污染，如支原体污染等；另外，在细胞治疗的过程中还会诱发免疫反应。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的在于克服现有技术中多能干细胞的培养过程中使用的培养基中往往含有动物源成分，从而在分化过程中出现误差或是引入动物源性污染等问题，从而提供一种不含有动物源成分，并且能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，同时制备方法步骤简单、原料易得，且培养的细胞代次多，增殖能力强，状态好的人多能干细胞培养基及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种人多能干细胞培养基，其中，所述人多能干细胞培养基含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素生长因子、bFGF、转铁蛋白和转化生长因子β信号通路抑制剂。本专利技术还提供了一种人多能干细胞培养基的制备方法，其中，所述制备方法包括：1)将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素生长因子、bFGF、转铁蛋白和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物M1；2)将混合物M1调节pH和渗透压，得到混合物M2；3)将混合物M2进行灭菌处理，制得细胞培养基。本专利技术还提供了一种人多能干细胞培养基在培养人多能干细胞向多种细胞分化中的应用，其中，所述人多能干细胞培养基如上所述。通过上述技术方案，本专利技术提供的细胞培养基通过DMEM培养基与F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素生长因子、bFGF、转铁蛋白和转化生长因子β信号通路抑制剂的协同作用以向培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，使得培养细胞具有优异的自我更新能力。同时该培养基中未使用动物源成分，进而有效地规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。另外，该细胞培养基的制备方法步骤简单、原料易得，不含血清，专门用于人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞在无饲养层细胞条件下的培养与扩增。该培养基可保持hESC和hiPSCs的未分化、多能状态。培养基中动物血清的去除可以大大避免动物成分对人类多能干细胞培养的干扰，简化培养过程，增加实验结果的可信度。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是应用例1中扩增第4代时的人类多能干细胞的形态图；图2是应用例1中扩增第15代时的人类多能干细胞的形态图；图3是应用例1中扩增15代次的增值曲线图；图4是应用例1中扩增15代后的人类多能干细胞的多能性蛋白标志物Sox2、Oct4、Nanog、TRA1-81的鉴定；图5是应用例1中扩增15代后的人类多能干细胞向多种细胞分化能力的鉴定；图6-图8是应用例1中扩增15代后的人类多能干细胞向神经细胞分化能力的鉴定；其中，图6中采用Nestin和Sox2标记的为神经干细胞，图7中采用Tuji标记的为神经元细胞，图8采用Map2标记的为神经元细胞；图9是应用例1中扩增15代后的人类多能干细胞向心肌细胞分化能力的鉴定；图10是应用例1中扩增15代后的人类多能干细胞向血管内皮细胞分化能力的鉴定。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人多能干细胞培养基，其特征在于，所述人多能干细胞培养基含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素生长因子、bFGF、转铁蛋白和转化生长因子β信号通路抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种人多能干细胞培养基，其特征在于，所述人多能干细胞培养基含有DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素生长因子、bFGF、转铁蛋白和转化生长因子β信号通路抑制剂。2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述DMEM培养基与所述F12培养基的含量的体积比为1:1-4；且，以所述细胞培养基的总量为基准，所述维生素C的浓度为1-100μg/mL，所述胰岛素生长因子的浓度为1-100ng/mL，所述bFGF的浓度为1-200ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-50ng/mL，所述硒酸钠的浓度为1-100μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为100-1000mg/L，所述转铁蛋白的浓度为1-50μg/mL；优选地，所述维生素C的浓度为20-100μg/mL，所述胰岛素生长因子的浓度为5-100ng/mL，所述bFGF的浓度为5-150ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为1-20ng/mL，所述硒酸钠的浓度为1-50μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为200-700mg/L，所述转铁蛋白的浓度为5-50μg/mL；更为优选地，所述维生素C的浓度为50-100μg/mL，所述胰岛素生长因子的浓度为20-60ng/mL，所述bFGF的浓度为50-100ng/mL，所述转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为5-10ng/mL，所述硒酸钠的浓度为2-30μg/L，所述碳酸氢钠的浓度为400-600mg/L，所述转铁蛋白的浓度为10-30μg/mL。3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，所述转化生长因子β信号通路抑制剂选自牌号为SB431542的转化生长因子β信号通路抑制剂。4.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，所述细胞培养基的pH值为7.3-8；优选地，所述细胞培养基的渗透压为320-360mOsm/kg。5.一种人多能干细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：1)将DMEM培养基、F12培养基、硒酸钠、碳酸氢钠、维生素C、胰岛素生长因子、bFGF、转铁蛋白和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物M1；2)将混合物M1调节pH和渗透压，得到混合物M2；3)将混合物M2进行灭菌处理，制得人多...

【专利技术属性】
技术研发人员：张竞方，孙亚平，
申请(专利权)人：宁波医诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33