红景天苷壳聚糖微球的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种红景天苷壳聚糖微球的制备方法及其应用。将壳聚糖溶于乙酸水溶液中，再将红景天苷溶于上述的壳聚糖溶液中，超声脱气备用，在一定滴加时间、转速的条件下，缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，得到壳聚糖微球溶液，超声、离心、洗涤、烘干后得到红景天苷壳聚糖微球。本发明专利技术通过体外试验首次证实红景天苷壳聚糖微球通过抑制COX‑2、5‑LOX和CYP4A介导的花生四烯酸代谢而使巨噬细胞偏离M1表型，并抑制巨噬细胞M1促转移因子的分泌和促转移脂质介质的产出，以此来抑制肿瘤转移和预转移巢的形成。本发明专利技术提供了红景天苷壳聚糖微球在制备抗肿瘤转移药物中的新用途，为制备抗肿瘤转移药物开拓了新思路及新研究领域。

Preparation and Application of Salidroside Chitosan Microspheres

【技术实现步骤摘要】
红景天苷壳聚糖微球的制备方法及其应用
本专利技术属于中药领域，具体涉及一种红景天苷壳聚糖微球的制备方法及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤已经成为导致人类发病和死亡的重要原因之一。在中国，发病率和死亡率位居前列的癌症有肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等。随着我国工业化速度加快，环境污染加重，以及人口老龄化加剧，癌症的发病率和死亡率将进一步增加。尽管癌症的手术治疗、分子靶向治疗和免疫治疗等均有较大进展，但五年存活率仍较低。肿瘤的转移是导致患者死亡的重要原因，如肺癌患者中高达90％死于转移(HanahanDetal,2011)。肿瘤细胞转移至远端器官前，肿瘤组织可分泌大量因子促进远端转移位点建立适宜肿瘤细胞定植的微环境，即“预转移巢”(Pre-metastaticniche)。预转移巢形成是肿瘤转移的早期阶段，也是研究抗肿瘤转移药物的关键作用位点。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是存在于实体瘤组织中的巨噬细胞。研究发现，在肿瘤组织微环境中TAM数量越多，患者预后越差。机体中抗原提呈T细胞(Th1)等释放的干扰素-γ(IFN-γ)或细菌脂多糖(LPS)均能活化巨噬细胞使之形成M1型巨噬细胞，进而释放多种促炎性因子，趋化因子等，如TNF-α和IL-1β。其中，TNF-α通过激活NF-κB信号通路增加癌细胞的转移潜能(ChoUetal,2018)；Th2细胞释放的IL-4和IL-13等细胞因子则能够诱导巨噬细胞活化形成M2型巨噬细胞，能够大量合成免疫抑制因子和多种促肿瘤生长的细胞因子，如IL-10、TGF-β、MMP-2/9，具有抑制炎症反应和促进肿瘤细胞生长转移的功能(LiRetal,2019)。肿瘤细胞释放于预转移巢的外泌体等因子，可以在预转移巢募集巨噬细胞，促进肿瘤转移(NielsenS.Retal,2017)。因此，抑制巨噬细胞向M1型或向M2型极化，减少TAM的数量，可以抑制肿瘤转移和预转移巢的形成。肿瘤相关巨噬细胞中COX-2、5-LOX和CYP4A介导的花生四烯酸代谢与肿瘤转移密切相关。单一COX-2抑制剂在阻断COX-2代谢的同时会将花生四烯酸代谢分流到另一途径，从而降低功效并加剧不良反应(HeCetal,2012)。肿瘤相关巨噬细胞中环加氧酶(COX)-2，5-脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450(CYP)4A主要分别将花生四烯酸(AA)代谢为前列腺素E2(PGE2)，白三烯B4(LTB4)和20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)(YarlaNSetal,2016)，通过STAT1和NF-κB信号转导使巨噬细胞向M1样极化，增加IL-1β和TNF-α分泌，募集中性粒细胞向预转移巢聚集(YanzhuoLiuetal,2019)。PGE2可以在预转移巢募集骨髓源性细胞，为肿瘤细胞定植提供条件，COX-2抑制剂可有效抑制肿瘤的转移(LiuSetal,2014)。CYP4A通过STAT3信号通路诱导巨噬细胞向M2样极化，增加基质金属蛋白酶(MMP)-2/9表达及血管内皮生长因子受体(VEGFR)1阳性的髓样细胞募集，形成有利于肿瘤细胞侵袭转移的预转移微环境(XWChenetal,2017)。因此，抑制巨噬细胞内COX-2、5-LOX和CYP4A的表达，可以抑制肿瘤转移和预转移巢的形成。此外，传统上认为，中性粒细胞在肿瘤发展中作为旁观者。然而，新的证据表明，肿瘤可以操纵中性粒细胞，在分化早期创造不同的表型和功能极化状态以改变肿瘤行为，还可以改变其他免疫细胞的行为，促进肿瘤转移(CoffeltSBetal,2016)。此外，中性粒细胞浸润可以促进转移前巢的形成，促进肿瘤转移。这是由于前转移蛋白的表达增强，如Bv8，MMP9，S100A8和S100A9，导致中性粒细胞对肿瘤细胞的杀伤作用减弱(WuCFetal,2015)。因此，抑制中性粒细胞的迁移，可以抑制肿瘤转移和预转移巢的形成。红景天苷(Salidroside)，对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是存在于红景天属、越桔属、杜鹃花属、女贞属等植物中的天然抗氧化剂(邹亮等人,2011)，通过提高细胞的抗氧化能力，清除活性氧，调控炎性细胞因子表达和抑制炎症介质合成，从而产生抗炎作用和防止癌变的发生。红景天苷具有比较广泛的药理作用，如神经保护作用、心血管保护作用，且具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节作用(张明发等人,2012)。迄今为止，红景天苷通过干预巨噬细胞中COX-2、5-LOX和CYP4A介导的花生四烯酸代谢而抑制肿瘤转移的作用尚未见报道。同时，研究表明，口服红景天苷在大鼠体内的绝对生物利用度仅为33.17％(吴浩等人,2014)，生物利用度过低。
技术实现思路
本专利技术对红景天苷抗肿瘤转移的研究属于首次，为增加红景天苷生物利用度，将其制备成生物利用度高的红景天苷-壳聚糖微球进行研究，为制备抗肿瘤转移药物开拓了新思路及新研究领域。本专利技术提供了一种红景天苷壳聚糖微球的制备方法及其应用。本专利技术采取的具体技术方案为：本专利技术第一方面，提供一种红景天苷壳聚糖微球的制备方法，其制备方法如下：(1)称取壳聚糖溶于1％乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，得到10mg/mL的壳聚糖溶液；(2)称取红景天苷溶于上述壳聚糖溶液中，使溶液中壳聚糖与红景天苷的质量比为5:1；，搅拌均一，超声脱气，得到红景天苷壳聚糖溶液；(3)称取三聚磷酸钠适量，溶于一定体积重蒸水中配制成1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，在600r/min的条件下，向上述步骤(2)得到的红景天苷壳聚糖溶液中缓慢滴加配置好的1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，所述三聚磷酸钠溶液与上述红景天苷壳聚糖溶液体积比为2:5，继续搅拌0.5h，离心收集沉淀，石油醚洗涤三次，真空干燥后即得。本专利技术第二方面，提供上述红景天苷壳聚糖微球的制备方法制得的红景天苷壳聚糖微球在制备抗肿瘤转移药物中的新用途，红景天苷壳聚糖微球利用其在抑制肿瘤转移及预转移巢形成中的作用，从而用于抗肿瘤转移药物。本专利技术通过体外试验，首次证实红景天苷壳聚糖微球通过抑制COX-2、5-LOX和CYP4A介导的花生四烯酸代谢而使巨噬细胞偏离M1表型；流式细胞术显示在体外培养的RAW264.7巨噬细胞中，红景天苷(150μM)壳聚糖微球和红景天苷(300μM)壳聚糖微球均可以抑制尿酸钠(MSU)诱导的CD86的表达；同样地，在体外培养的RAW264.7巨噬细胞和NR8383巨噬细胞中，红景天苷(150μM)壳聚糖微球和红景天苷(300μM)壳聚糖微球均可以下调M1基因(iNOS和CD86)表达和细胞因子(TNF-α和IL-1β)分泌；此外，红景天苷(150μM)壳聚糖微球和红景天苷(300μM)壳聚糖微球均减少了MSU晶体处理的RAW264.7巨噬细胞和NR8383巨噬细胞中PGE2，LTB4和20-HETE的产生。本专利技术同时研究了上述过程对中性粒细胞聚集的影响，发现红景天苷(150μM)壳聚糖微球和红景天苷(300μM)壳聚糖微球均可以显著减少MSU引起的中性粒细胞迁移，但此作用可因COX-2、5-LOX和CYP4A过表达或外源性添加IL-1β和TNF-α而部分逆转。这表明，红景天苷壳聚糖微球抑制COX-2、5-LOX和CYP4A，进而通过减少M1巨噬细胞来源的细胞因子，特别是IL-1β和T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种红景天苷壳聚糖微球的制备方法，其特征在于：所述红景天苷壳聚糖微球的制备方法如下，(1)称取壳聚糖溶于1％乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，得到10mg/mL的壳聚糖溶液；(2)称取红景天苷溶于上述壳聚糖溶液中，使溶液中壳聚糖与红景天苷的质量比为5:1；，搅拌均一，超声脱气，得到红景天苷壳聚糖溶液；(3)称取三聚磷酸钠适量，溶于一定体积重蒸水中配制成1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，在600r/min的条件下，向上述步骤(2)得到的红景天苷壳聚糖溶液中缓慢滴加配置好的1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，所述三聚磷酸钠溶液与上述红景天苷壳聚糖溶液体积比为2:5，继续搅拌0.5h，离心收集沉淀，石油醚洗涤三次，真空干燥后即得。

【技术特征摘要】
1.一种红景天苷壳聚糖微球的制备方法，其特征在于：所述红景天苷壳聚糖微球的制备方法如下，(1)称取壳聚糖溶于1％乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，得到10mg/mL的壳聚糖溶液；(2)称取红景天苷溶于上述壳聚糖溶液中，使溶液中壳聚糖与红景天苷的质量比为5:1；，搅拌均一，超声脱气，得到红景天苷壳聚糖溶液；(3)称取三聚磷酸钠适量，溶于一定体积重蒸水中配制成1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，在600r/min的条件下，向上述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨静，秦亦瑄，赵有为，刘妍灼，李鑫磊，胡玲曦，彭玉清，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42