一种微生物传感器的构建方法及其应用方法技术

本发明专利技术提供了一种微生物传感器的构建方法及应用方法，步骤一构建待测氨基酸缺陷型菌株；步骤二截取LuxI/LuxR循环放大线路所需目的基因片段连接，得到含有基于LuxI/LuxR系统的循环放大线路的质粒，将重组质粒转化到氨基酸缺陷型菌株中，使报告基因片段重复表达；步骤三将菌株培养至对数生长期，在培养基中饥饿培养。本发明专利技术利用循环放大待测氨基酸缺陷型菌株作为微生物传感器，以与蛋白质标志物具有高特异性和高亲和力结合的核酸适配体作为“桥梁”，将对蛋白标志物的检测转化为对待测氨基酸的检测，利用构建的微生物传感器实现了对大分子生物标志物的检测，并且结合循环放大系统作为信号放大手段，大大提高了定量检测的灵敏度。

Construction and application of a microbial sensor

【技术实现步骤摘要】
一种微生物传感器的构建方法及其应用方法
本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种微生物传感器的构建方法及其应用方法。
技术介绍
生物标志物是在疾病发生过程中发生显著改变的分子，可以是核酸、蛋白质、代谢物、同工酶或激素等，具有疾病预警、疾病诊断和疾病预后等意义。生物标志物可以客观地测量和评价正常的生物过程、致病过程或治疗性干预的药理学反应。目前，生物标志物定量检测方法有酶联免疫法(ELISA)、化学发光免疫分析和荧光免疫分析等，这些方法大都需要复杂的仪器、检测灵敏度相对较低，很难实现低含量生物标志物的有效检测，难以满足临床诊断对生物标志物高灵敏检测的需求。微生物传感器以微生物作为敏感感应元件，结合电化学或光学等换能器，对环境中的某些特殊毒性物质或物理胁迫产生响应反应，将待测信号转换成具有一定函数关系的便于测量的信号，进而用来定量检测空气、土壤或水中的特定化学物质含量及物理胁迫程度。作为敏感元件的微生物具有廉价易培养、生长周期短、具有大量的合成生物学研究基础等优势，近年来，合成生物学的快速发展为基因工程微生物的构建提供了一种新方法，并从DNA水平上操控微生物传感器的选择性和灵敏度提供了新方向。应用合成生物学技术构建的生物传感器已经在环境监测、医学诊断、食品营养、军事工业等领域取得了进展。如通过将识别特定金属离子的调节蛋白与下游报告基因的表达联系起来，构成生物传感线路，在识别特定金属离子过程中，调节蛋白或酶活性水平发生改变，通过对信号的检测，定量环境中的特定金属离子。细菌的群体感应(quorumsensing,QS)是依赖信号分子密度识别的一种细胞之间相互交流的通讯机制，可调控基因表达，是细菌胞外信号传导调控基因表达的生理学过程。很多细菌可以低水平地合成并分泌小分子信号分子(自诱导物)，当信号分子的浓度处于低水平时，不会诱导下游基因的表达，当细菌数量增加，信号分子浓度积累达到阈值时，会诱导下游相关结构基因及自身合成基因的表达，进而产生更高浓度的自诱导物，形成正反馈循环，使信号循环放大，进行群体行为调控。LuxI/LuxR系统是革兰氏阴性菌典型的群体感应系统，在系统中，LuxI合酶促进自诱导物—酰基高丝氨酸内酯的衍生物(AHL)的合成，LuxR蛋白为调节蛋白，负责识别AHL，可以与AHL结合形成AHL-LuxR复合物，正反馈调节上游启动子的活性，促进下游LuxI/LuxR蛋白的表达，进一步促进自诱导剂的合成，形成一个正反馈调节机制，构成循环放大线路。现有的微生物传感器的设计原理大部分是基于启动子对于待测物的特异性识别而启动下游报告基因表达来实现的。要求调节基因/启动子对目标物具有特定响应才能进行增强表达或启动，而具有临床检测意义的大部分生物标志物都是大分子蛋白质，无法直接进入微生物体内，因此，微生物传感器多用于小分子物质如重金属离子、氨基酸等的定量检测，尚未见诸用于蛋白质等大分子定量检测的报道。可以预期以核酸适配体作为特异性识别分子和“桥梁”，将蛋白质生物大分子转化成氨基酸小分子，通过微生物传感器转换成便于定量检测的荧光信号，通过浓度与荧光强度的线性关系，实现蛋白质生物标志物的定量检测。因此，基于循环放大系统的微生物传感器，结合磁珠偶联竞争的、适配体特异性识别的蛋白质生物标志物定量检测方法对疾病的早期预测、诊断和预后具有重要的现实意义和临床应用价值。
技术实现思路
为了克服现有技术上的问题，本专利技术提供一种微生物传感器的构建方法及其应用方法，以循环放大氨基酸缺陷型菌株作为生物底盘的微生物传感器，以核酸适配体作为蛋白标志物的特异性识别分子，从待测样品中“抓取”蛋白质标志物，继而竞争释放原本与核酸适配体的互补链分子，通过磁分离，检测上清液中互补链分子上结合的氨基酸含量，继而实现待测样品中蛋白标志物含量的定量检测。本专利技术提供以下技术方案：一种微生物传感器的构建方法，包括以下步骤：步骤一构建待测氨基酸的缺陷型菌株；步骤二构建以荧光蛋白基因为报告基因的质粒，截取LuxI/LuxR循环放大线路所需目的基因片段，连接构建，得到含有基于LuxI/LuxR系统的循环放大线路的质粒，将重组质粒转化到感受态的由步骤一中获得的菌株中，使报告基因片段重复表达，获得具有信号循环放大能力的微生物传感器；步骤三将步骤二中获得的菌株培养至对数生长期，在培养基中饥饿培养，耗尽菌株中内源性的待测氨基酸分子。进一步地，其中步骤二包括以下步骤：步骤二a构建以荧光蛋白基因为报告基因的质粒，提取质粒，转化到感受态的待测氨基酸缺陷型菌株中，筛选阳性菌落，得到报告基因菌株荧光传感体系；步骤二b从质粒载体上双酶切获得循环放大线路所需目的基因片段，通过T4DNA连接酶进行顺次连接，完成循环放大线路质粒的构建；步骤二c将构建完成的质粒转化到感受态细胞中，涂布对应抗性的LB平板，筛选阳性单克隆；步骤二d将阳性单克隆接种于对应抗性的液体LB培养基进行扩大培养，然后提取质粒，转化到感受态的步骤一中获得的菌株中，涂布对应抗性的LB平板，筛选阳性单克隆，获得循环放大待测氨基酸缺陷型菌株，即将待测氨基酸信号放大的微生物传感器。进一步地，在步骤二a后还包括步骤二a1：对报告基因菌株荧光传感体系进行饥饿培养消耗掉内源性待测氨基酸分子，并检测报告基因菌株荧光传感体系对待测氨基酸的响应敏感度。进一步地，还包括步骤四向微生物传感器菌液中分别添加具有浓度梯度的待测氨基酸溶液，培养菌液，并分别检测荧光强度，构建待测氨基酸浓度与荧光强度的工作曲线，检测微生物传感器对待测氨基酸的响应敏感度。进一步地，所述荧光蛋白基因为gfp基因、yfp基因、rfp基因或bfp基因中的一种或几种，所述检测氨基酸为赖氨酸、甘氨酸、色氨酸、丝氨酸或亮氨酸，所述菌株为大肠杆菌或酵母菌。进一步地，所述所需目的基因片段分别为组成型启动子Pj23100-RBS、诱导酰基高丝氨酸内酯的受体结合蛋白基因Plux-RBS-luxR、酰基高丝氨酸内酯合成酶基因RBS-luxI和绿色荧光蛋白基因RBS-gfp-T-T。进一步地，所述待测氨基酸为单体氨基酸或多肽。一种应用微生物传感器的蛋白生物标志物定量检测的方法，包括以下步骤：步骤一根据待测蛋白生物标志物选择核酸适配体，在磁珠-核酸适配体偶联物中加入互补链，所述互补链末端修饰待测氨基酸分子，得到磁珠-核酸适配体-互补链的偶联物；步骤二将不同浓度梯度的蛋白生物标志物及待测样品分别加入到磁珠-核酸适配体-互补链的偶联物中，蛋白标志物与互补链竞争结合核酸适配体，蛋白质标志物与核酸适配体结合，释放出互补链；步骤三磁分离后，分别向互补链游离溶液中加入所述微生物传感器，进行菌株培养；步骤四检测菌液里的荧光强度，绘制荧光强度与蛋白生物标志物浓度之间的标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中蛋白标志物的浓度。进一步地，所述磁珠-互补链偶联物通过链霉亲和素-生物素系统偶联。进一步地，所述互补链分子与核酸适配体的左侧15nt碱基互补配对。采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术的定量检测方法中使用易合成、易修饰、便于操作且能与生物标志物特异性结合的核酸适配体与待测氨基酸如赖氨酸进行偶联，搭起生物标志物与待测氨基酸之间的桥梁，大大降低了检测难度；2、利用循环放大待测氨基酸缺陷型菌株作为微生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一 构建待测氨基酸的缺陷型菌株；步骤二 构建以荧光蛋白基因为报告基因的质粒，截取LuxI/LuxR循环放大线路所需目的基因片段，连接构建，得到含有基于LuxI/LuxR系统的循环放大线路的质粒，将重组质粒转化到感受态的由步骤一中获得的菌株中，使报告基因片段重复表达，获得具有信号循环放大能力的微生物传感器；步骤三 将步骤二中获得的菌株培养至对数生长期，在培养基中饥饿培养，耗尽菌株中内源性的待测氨基酸分子。

【技术特征摘要】
1.一种微生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一构建待测氨基酸的缺陷型菌株；步骤二构建以荧光蛋白基因为报告基因的质粒，截取LuxI/LuxR循环放大线路所需目的基因片段，连接构建，得到含有基于LuxI/LuxR系统的循环放大线路的质粒，将重组质粒转化到感受态的由步骤一中获得的菌株中，使报告基因片段重复表达，获得具有信号循环放大能力的微生物传感器；步骤三将步骤二中获得的菌株培养至对数生长期，在培养基中饥饿培养，耗尽菌株中内源性的待测氨基酸分子。2.根据权利要求1所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，其中步骤二包括以下步骤：步骤二a构建以荧光蛋白基因为报告基因的质粒，提取质粒，转化到感受态的待测氨基酸缺陷型菌株中，筛选阳性菌落，得到报告基因菌株荧光传感体系；步骤二b从质粒载体上双酶切获得循环放大线路所需目的基因片段，通过T4DNA连接酶进行顺次连接，完成循环放大线路质粒的构建；步骤二c将构建完成的质粒转化到感受态细胞中，涂布对应抗性的LB平板，筛选阳性单克隆；步骤二d将阳性单克隆接种于对应抗性的液体LB培养基进行扩大培养，然后提取质粒，转化到感受态的步骤一中获得的菌株中，涂布对应抗性的LB平板，筛选阳性单克隆，获得循环放大待测氨基酸缺陷型菌株，即将待测氨基酸信号放大的微生物传感器。3.根据权利要求2所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，在步骤二a后还包括步骤二a1：对报告基因菌株荧光传感体系进行饥饿培养消耗掉内源性待测氨基酸分子，并检测报告基因菌株荧光传感体系对待测氨基酸的响应敏感度。4.根据权利要求1所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，还包括步骤四向微生物传感器菌液中分别添加具有浓度梯度的待测氨基酸溶液，培养菌液，并分别检测荧光强度，构建待测氨基酸浓度与...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪飞，张静，邓玉林，陶慧，杨元展，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11