一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒，并公开了用于预测早发型子痫前期发病的核苷酸序列SEQ ID NO.1，以及针对该核苷酸序列的正向引物序列SEQ ID NO.2和反向引物序列SEQ ID NO.3。本发明专利技术所述的检测试剂盒能够应用于临床实验操作，该试剂盒提供的检测方法简单，指标单一，预测的特异性达到100%，灵敏度达到88.9%，相对于已有检测方法，特异性和灵敏度极大提高。因此，本发明专利技术所公开的检测试剂盒在早发型子痫前期发病预测方面具有广泛的应用前景。

A test kit for predicting the onset of early-onset preeclampsia

【技术实现步骤摘要】
一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒。
技术介绍
早发型子痫前期是妊娠期严重疾病，一般在妊娠20周以后发病，发病特征为血压持续升高（≥160/110mmHg）。可导致孕妇产后出血、胎盘早剥、早产、死胎等并发症，常造成严重的母婴发病率及死亡率。早发型子痫前期在我国的发病率约为3%以内，子痫前期在我国的发病率约为2-8%。因此，如能及早预测，并进行适时干预，将极大的减少母婴发病率及死亡率。目前临床上对早发型子痫前期的预测还依赖于医师对血压、蛋白尿及靶器官损害的筛查，尚未有环状RNA（circRNA）检测水平的预测方法。已有研究报道的一些预测方法，如血浆生物标志物和易感基因，由于其特异性差，灵敏性低，或需要多分子联合诊断预测，无法真正应用于临床。CircRNA存在于人的血液和尿液当中，为环状RNA，在体内能稳定表达，不易降解。利用目前最为成熟的分子型诊断技术即实时聚合酶链反应（QuantitativeReal-timePolymeraseChainReaction），设计特异性引物，即可实施检测。因此，为提高对早发型子痫前期发病预测的特异性和灵敏度，本领域的技术人员致力于寻找血液预测的诊断标志物（circRNA），开发出用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是找到能准确预测早发型子痫前期发病的circRNA，开发出能用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒，提高早发型子痫前期发病预测的特异性和灵敏度。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种用于预测早发型子痫前期发病的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒，包括针对权利要求1所述核苷酸序列的正向引物序列SEQIDNO.2和反向引物序列SEQIDNO.3。进一步的，以上所述的用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒还包括管家基因β-actin以及管家基因的引物。进一步的，以上所述的用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒还包括总RNA抽提试剂、和/或cDNA反转录试剂、和/或PCR定量试剂。进一步的，所述总RNA抽提试剂为RNAisoplus试剂。进一步的，所述cDNA反转录试剂为cDNAfirststrandsynthesis试剂。进一步的，所述PCR定量试剂为SYBRGreenI。进一步的，所述检测试剂盒的反应条件为：95℃3min，95℃10s，60℃30s，40个循环。进一步的，待测样本与阴性样本的ΔCt值>3.2，即可初步判断为早发型子痫前期。有益效果：本专利技术提供了一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒，本专利技术首次通过环状RNA检测水平对早发型子痫前期发病进行预测，解决了现有检测方法特异性差、灵敏度低的技术问题，以及多分子联合诊断方法检测复杂度高的问题。本专利技术所述的检测试剂盒能够应用于临床实验操作，该试剂盒提供的检测方法简单，指标单一，预测的特异性达到100%，灵敏度达到88.9%，相对于已有检测方法，特异性和灵敏度极大提高。因此，本专利技术所公开的检测试剂盒在早发型子痫前期发病预测方面具有广泛的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施的9例早发型子痫前期和5例阴性对照预测模型ROC曲线图。图2为q-PCR验证RNA-seq测序获得的10条差异倍数最大的circRNAs结果图，其中EOPE为早发型子痫前期，CON为阴性对照组。图3为10条circRNAs引物的溶解曲线图谱。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。本实施例所用试剂如下：总RNA抽提用RNAisoplus试剂（厂家：宝日医生物技术有限公司（Takara中国），货号：9108）、cDNAfirststrandsynthesis反转录试剂（厂家：宝日医生物技术有限公司（Takara中国），货号：RR047A）、PCR定量试剂SYBRGreenI（厂家：宝日医生物技术有限公司（Takara中国），货号：RR420）、引物序列均由上海生工生物有限公司合成。1.预选用于预测早发型子痫前期发病的核苷酸序列我们通过对早发型子痫前期和正常孕妇的血液进行RNA-seq（核糖核酸测序）分析，发现了差异表达的基因，如：circRNA_13127、circRNA_06354、circRNA_04163、circRNA_02312、circRNA_00667、circRNA_14014、circRNA_06943、circRNA_05067、circRNA_02485、circRNA_00733。2.筛选用于预测早发型子痫前期发病的核苷酸序列2.1RNA的提取及cDNA的合成：1)采集外周血2mL（采血时间一般为早晨或上午），迅速转入2mL的EDTA抗凝管中，用手上下颠倒混匀多次。2)吸取EDTA抗凝管中的全血2mL，转入10mL离心管中，再加入3倍体积的红细胞裂解液6mL，反复颠倒混匀，室温放置10分钟。3)3000rpm，4℃离心10分钟，吸去上清，细胞沉淀中再加入2mL的红细胞裂解液，轻轻悬浮。4)3000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，白细胞沉淀留下。5)在白细胞中加入1mLtrizol，用移液枪反复吹打混匀，然后转入2mL的冻存管中，-80℃保存。6)含有trizol的白细胞拿出来，冻融，室温静置5分钟。7)加入1/5的氯仿，盖紧离心管盖，在涡旋振荡仪上剧烈震荡，室温静置5分钟。8)12000rpm，4℃离心15分钟。9)吸取无色的上清液到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10分钟。10)12000rpm，4℃离心10分钟，试管底部会出现沉淀。11)加入1mL75%乙醇，12000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。12)RNA沉淀干燥5分钟左右，加入适量RNase-free水，溶解沉淀，保存于-80℃。13)在离心管中配制以下混合液：random6mers（50µmol）1µL，dNTPMixture（10mMeach）1µL，模板RNA2µg，RNasefreedH2Oupto10µL。14)65℃保温5分钟后，冰上迅速冷却。15)在上述离心管中配制以下混合液：上述变性后反应液10µL，5×PrimescriptⅡbuffer4µL，Rnaseinhibitor（40U/µL）0.5µL，PrimescriptⅡRTase（200U/µL）1µL，RNasefreedH2Oupto20µL。16)30℃，10分钟17)95℃，5分钟18)收集合成的cDNA，储存于-80℃备用。2.2荧光定量PCR引物设计：应用美国国家生物信息中心（NCBI）数据库中的primer-blast软件设计上升和下降差异最大的各5对circRNAs引物，每条circRNA设计一对引物。并且在进行荧光PCR检测实验操作之前，验证每条circRNA基因序列的引物特异性：以cDNA为模板本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种用于预测早发型子痫前期发病的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于预测早发型子痫前期发病的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒，其特征在于，包括针对权利要求1所述核苷酸序列的正向引物序列SEQIDNO.2和反向引物序列SEQIDNO.3。3.根据权利要求2所述的一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒，其特征在于，还包括管家基因β-actin以及管家基因的引物。4.根据权利要求3所述的一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒，其特征在于，还包括总RNA抽提试剂、和/或cDNA反转录试剂、和/或PCR定量试剂。5.根据权利要求4所述的一种用于预测早发型子痫前期发病的检测试剂盒，其特征在于，所述总RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏杰，孙淼，徐智策，陈雄辉，张跃明，李凌君，周秀文，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32