与黄萎病抗性相关的GhCML20基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了与黄萎病抗性相关的GhCML20基因及其应用。本发明专利技术提供了如下1)～4)中任一所述的DNA分子在增强或降低植物对黄萎病抗性中的应用：1)其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；2)其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；3)其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；4)其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子。研究棉花GhCML20基因在抗黄萎病中的作用，有利于陆地棉抗黄萎病基因工程育种的进一步开展，为黄萎病的预防和控制提供借鉴和参考。

GhCML20 Gene Associated with Verticillium Wilt Resistance and Its Application

【技术实现步骤摘要】
与黄萎病抗性相关的GhCML20基因及其应用
本专利技术涉及生物领域，特别涉及与黄萎病抗性相关的GhCML20基因及其应用。
技术介绍
我国是世界上最大的产棉国之一，在国民经济中占有重要地位。由大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)引起的棉花黄萎病是影响我国和世界棉花生产的最重要病害之一，被称为棉花的“癌症”。大丽轮枝菌为重要的土壤习居性植物病原菌，其微菌核抗逆能力强，在土壤中可存活10年以上，在与寄主协同进化过程中，常受到病菌异核现象和环境条件的影响，导致病原菌致病力发生变化，产生新的生理类型，至今没有特效的化学防治药剂。因此，要实现对棉花黄萎病的有效防治，培育抗病品种是最有效的方法。陆地棉抗黄萎病遗传资源匮乏，在棉花上还未克隆到主效的抗病基因，而且抗病基因所介导的抗性只对特定的病原菌小种有效，易因病原菌的变异而丧失抗性作用，导致病害的重新爆发和流行，给农业生产造成巨大损失。因此，开发和利用新型针对棉花黄萎病的抗病相关基因显得尤为迫切和重要。
技术实现思路
为了弥补以上领域的不足，本专利技术提供了与黄萎病抗性相关的GhCML20基因及其应用。本专利技术的一个目的是提供：如下1)～4)中任一所述的DNA分子在增强或降低植物对黄萎病抗性中的应用：1)其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的DNA分子；3)其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的DNA分子；4)其核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的DNA分子。所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。所述植物为棉花或拟南芥。本专利技术的另一个目的是提供一种制备对黄萎病抗性增强的转基因拟南芥的方法。本专利技术所提供的制备对黄萎病抗性增强的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：将核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的DNA分子导入出发植物拟南芥中，得到转基因拟南芥；与出发植物拟南芥相比，转基因拟南芥对黄萎病抗性增强；所述将核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的DNA分子导入出发植物中是指将装载有所述如SEQIDNo.4所示的DNA分子的重组表达载体导入出发植物拟南芥中。所述重组表达载体是将所述如SEQIDNo.4所示的DNA分子插入出发载体pPZP111-eGFP的多克隆位点得到的。所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。本专利技术的又一个目的是提供一种制备对黄萎病抗性降低的转基因棉花的方法。本专利技术所提供的制备对黄萎病抗性降低的转基因棉花的方法，包括如下步骤：将连接有核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的DNA分子的沉默载体导入到出发植物棉花中，得到转基因棉花；选出与出发植物棉花相比黄萎病抗性降低的转基因植物个体，即得到对黄萎病抗性降低的转基因棉花。所述棉花为陆地棉中植棉KV3。所示沉默载体的出发载体为棉花皱缩病毒沉默载体pCLCrVA。所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。钙调蛋白类似蛋白(CML)是一类Ca2+感受蛋白，在植物发育和抗病过程中起重要调控作用。研究棉花GhCML20基因在抗黄萎病中的作用，有利于陆地棉抗黄萎病基因工程育种的进一步开展，为黄萎病的预防和控制提供借鉴和参考。附图说明图1为GhCML20基因克隆、菌落PCR检测电泳图；其中，M：200bpmarker，1-2为GhCML20基因克隆结果，3-5为菌落PCR检测结果。图2为GhCML20保守结构域。图3为CML20多序列比对结果。图4为CML20系统进化发育树。图5为接种大丽轮枝菌V991：0、3、6、12、18、24、36、48、96、144h的中植棉KV3根部GhCML20基因的表达情况。图6为中植棉KV3各组织中GhCML20表达量分析结果。图7为GhCML20基因沉默载体构建，其中，泳道1为GhCML20基因沉默目的片段扩增；泳道2为中间载体pEASY-T-GhCML20双酶切验证；泳道3为沉默载体pCLCrVA-GhCML20双酶切验证；泳道4为沉默载体pCLCrVA-GhCML20转化农杆菌菌落PCR验证。图8为沉默GhCML20基因的中植棉KV3抗病性鉴定结果，其中，A,野生型棉株(中植棉KV3)，B,中植棉KV3接种大丽轮枝菌V991，C,转化空载体(pCLCrVA+pCLCrVB)的中植棉KV3接种大丽轮枝菌V991，D,沉默GhCML20基因的中植棉KV3接种大丽轮枝菌V991。图9为超表达载体pPZP111-eGFP-GhCML20酶切验证结果，M：200bpmarker，1，pPZP111-eGFP-GhCML20质粒，pPZP111-eGFP-GhCML20载体双酶切。图10为转GhCML20基因拟南芥PCR验证结果，M,200bpmarker；1，野生型Col-0；2-10为转GhCML20基因植株。图11为转GhCML20基因拟南芥抗黄萎病鉴定结果，A，转化空载体pPZP111-eGFP拟南芥未接种对照；B，转化空载体pPZP111-eGFP拟南芥接种大丽轮枝菌V991；C，野生型拟南芥Col-0未接种对照；D，野生型拟南芥Col-0接种大丽轮枝菌V991；E,转化pPZP111-eGFP-GhCML20拟南芥未接种对照；F,转化pPZP111-eGFP-GhCML20拟南芥接种大丽轮枝菌V991。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。植物材料：陆地棉高抗黄萎病新品系中植棉KV3，在文献“ZhangW,ZhangH,QiF,JianG.GenerationoftranscriptomeprofilingandgenefunctionalanalysisinGossypiumhirsutumuponVerticilliumdahliaeinfection.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2016,473:879-885”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。拟南芥哥伦比亚型(Col-0)，在文献“SzabadosL,KovácsI,OberschallA,AbrahámE,KerekesI,ZsigmondL,NagyR,AlvaradoM,KrasovskajaI,GálM,BerenteA,RédeiGP,HaimAB,KonczC.Distributionof1000sequencedT-DNAtagsintheArabidopsisgenome.PlantJ.2002，32(2):233-42.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。载体和菌株：pEASY-T1Simple载体购自于全式金生物公司；棉花皱缩病毒沉默载体pCLCrVA和pCLCrVB，在文献“GuZ,HuangC,LiF,ZhouXP.AversatilesystemforfunctionalanalysisofgenesandmicroRNAsincotton.PlantBiotechnologyJournal,2014,12:1-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.如下1)～4)中任一所述的DNA分子在增强或降低植物对黄萎病抗性中的应用：1)其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA分子；2)其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；3)其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；4)其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.如下1)～4)中任一所述的DNA分子在增强或降低植物对黄萎病抗性中的应用：1)其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的DNA分子；3)其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的DNA分子；4)其核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的DNA分子。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄萎病为由黄萎病强致病力落叶型菌株V991引起的黄萎病。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为棉花或拟南芥。4.一种制备对黄萎病抗性增强的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：将核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的DNA分子导入出发植物拟南芥中，得到转基因拟南芥；与出发植物拟南芥相比，转基因拟南芥对黄萎病抗性增强；所述将核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的DNA分子导入出发植物中是指将装载有所述如SEQIDNo.4所示的DNA分子的重组表达载体导入出发植物拟南芥中。5.根据权利要求4所述的制备对黄萎病抗性增强的转基因拟南芥的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文蔚，张华崇，简桂良，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11