本发明专利技术涉及分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置及其方法，包括微通道芯片，其中央为磁环，磁环外周为环形的微通道腔体；磁环由多个钕铁硼材质永磁立方体按海尔贝克阵列方式排列组成，微通道腔体处于磁环形成的磁场区，磁环底部设置有磁环托盘，磁环托盘通过中心轴传动方式实现圆周转动；微通道腔体具有始端和末端；始端分叉并设置有外侧入口和内侧入口，外侧入口导入细胞悬液，内侧入口导入缓冲液；末端分叉并设置有外侧出口和内侧出口，内侧出口导出免疫细胞‑人CD45抗体‑磁颗粒复合物，外侧出口导出循环肿瘤细胞。本发明专利技术可连续、高效的从癌症患者具有极高免疫细胞浓度背景的样本中分选、富集获取数量稀少的CTC细胞。
A device and method for sorting and enriching rare circulating tumor cells
【技术实现步骤摘要】
分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置和方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置和方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从肿瘤原发灶或转移灶脱落后进入外周血，并存在于血液循环系统中的肿瘤细胞。理论上，CTC可以存在于肿瘤发生与发展各个阶段，是真正“完整”的肿瘤液体活检标记物，对肿瘤早诊、转移与预后评估具有重要科学研究与临床应用价值。如何从极其庞大的血细胞中尽可能分选富集更多的肿瘤细胞是CTC检测必需解决的首要难题。目前的CTC分选富集按原理可大体分为基于细胞物理特征差异和细胞表面特异抗原-抗体亲和反应两大类。受CTC具有含量稀少（每10毫升血液可能仅含有数个CTC，但却含有数亿血细胞）[2012,SciTranslMed,4(141):113p-141p.]、抗原异质性高（CTC可以发生EMT转化，分化与去分化等作用）、非典型形态（CTC具有与传统组织病理概念典型肿瘤细胞不同的形态、大小）等生物学特征影响，使得现有基于细胞大小（膜过滤法[2018,AdvDrugDelivRev,125:3-20.;2018,AdvDrugDelivRev,125:3-20.;2017,JChromatogrA,1162(2):154-161.;2000,AmJPathol,156(1):57-63.]、侧向流动[2018，BiomedMicrodevices,20(2):51.；2018，Biomicrofluidics,12(3):34105.;NatProtoc,9(3):694-710.]、螺旋式[2008，LabChip,8(11):1906-1914.；2013，SciRep,3:1259.；2012，AnalChem,84(21):9324-9331.；Analyst,139(13):3245-3255.;2016,NatProtoc,11(1):134-148.]、微阵列芯片[2018，AdvDrugDelivRev,125:78-93.；2009.JChromatogrA,1216(47):8289-8295.；2007，Nature,450(7173):1235-1239.；NanoToday,8(4):347-387.]，密度（2003，RecentResultsCancerRes,162:149-155.），带电性[2014,Cancers(Basel),6(1):545-579.;2009,Electrophoresis,30(8):1388-1398.2000,Biochemistry(Mosc),65(12):1429-1434.;1995,ProcNatlAcadSciUSA,92(3):860-864.]等物理特征的物理分离方法和基于肿瘤细胞表面特异抗原-抗体亲和反应的分选技术[2018，AnnOncol,29(7):1598-1600.；2015,PLoSOne,10(12):e144535.；2014,NatProtoc,9(3):694-710.;2012,Nature,487(7408):510-513.]很难从极高浓度背景的血细胞（数百亿）中分选出尺寸差异大，数量极为稀少、细胞分子标志差异化表达，以及细胞形态高度异质的循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞分选富集的另一策略是通过逐步裂解红细胞、抗免疫细胞共同抗原（CD45）-磁颗粒去除白细胞等成分-即阴性富集技术[2018，ClinChimActa,485:95-102.；2017，IntJMolSci,18(4).；2016,JExpClinCancerRes,35:66.;2015，BiosensBioelectron,67:86-92.；]实现血液中稀有细胞（含CTC）富集。其优势在于规避了基于CTC物理特征和表面分子的分选方法缺点，可最大程度上富集俘获所有类型的CTC[2015，Cancer,121(17):3036-3045.；2014，ClinCancerRes,20(18):4794-4805.；2009,BiotechnolBioeng,102(2):521-534.]。但使用常规的磁力架进行抗CD45—磁颗粒去除免疫细胞操作中，受免疫细胞极高的背景浓度影响，免疫细胞(CD45+)—磁颗粒向磁极运动过程中会将其运动路径上的CTC从溶液中裹携至磁极，造成溶液中CTC回收率降低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置和方法，可连续、高效的从癌症患者具有极高免疫细胞浓度背景的样本中分选、富集获取数量稀少的CTC细胞。本专利技术所采用的技术方案为：分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述装置包括微通道芯片，微通道芯片包括中央的磁环和磁环外周环形的微通道腔体；磁环由多个钕铁硼材质永磁立方体按海尔贝克阵列方式排列组成，磁环底部设置有磁环托盘，磁环托盘通过中心轴传动方式实现圆周转动；微通道腔体具有始端和末端；始端分叉并设置有外侧入口和内侧入口，外侧入口导入循环肿瘤细胞和免疫细胞-人CD45抗体-磁颗粒复合物的细胞悬液，内侧入口导入PBS缓冲液；末端分叉并设置有外侧出口和内侧出口，内侧出口导出免疫细胞-人CD45抗体-磁颗粒复合物，外侧出口导出循环肿瘤细胞。磁环的各个磁体的径向磁场相互迭加，构成磁环外侧强磁场强度的磁场，磁环处于微通道腔体的内侧同心圆之上。磁环底部的磁环托盘中心设置有轴承和传动轴，传动轴上设置有传动齿轮，传动齿轮与步进电机的主动齿轮啮合，从而实现步进电机对磁环托盘转动的控制。微通道腔体的外侧入口和内侧入口分别通过导管连接注射器；注射器安装于注射泵，注射泵通过螺纹转轴由步进电动机控制。微通道腔体的外侧出口和内侧出口分别通过导管连接收集管。微通道芯片中心具有上下贯通的圆形空腔，磁环托盘呈圆形并嵌于空腔内。微通道芯片中心的空腔外周设置环形的微通道腔体，微通道腔体底部外低内高，形成自内向外的斜坡，最外侧为平面。收集管为富集培养室，富集培养室分为由微孔膜分隔的富集培养室上腔体和富集培养室下腔体，顶部设置有富集培养室入口通道。基于所述装置的分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：由以下步骤实现：1）将血液样本进行红细胞裂解，去除红细胞；2）将去除了红细胞的样本与人CD45抗体-磁颗粒孵育；3）将与人CD45抗抗体-磁颗粒孵育后的细胞悬液样本经微通道腔体的外侧入口导入微通道腔体，同时内侧入口导入缓冲液，分别由各自动力装置控制速度；4）控制细胞悬液与缓冲液的导入速度，使细胞悬液起始时在微通道腔体的外侧腔体内作惯性流动；5）步进电机带动磁环托盘上的磁环发生圆周运动，运动方向与微通道腔体中的细胞悬液的惯性流动方向同向，步进电机控制磁环的圆周运动速度；6）通过控制磁环的圆周运动速度与微通道腔体内的细胞悬液的流动速度，使细胞悬液中的免疫细胞-人CD45抗体-磁颗粒复合物在磁场的作用下逐渐进入微通道腔体内侧腔体进行惯性流动；7）微通道腔体的另一端设置的外侧出口和内侧出口交叉处设置有显微镜观察区，可以实时观察微通道腔体中细胞悬液流入外侧出口或内侧出口的状态；8）通过控制微通道腔体的另一端设置的外侧出口本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述装置包括微通道芯片（1），微通道芯片（1）包括中央的磁环（2）和磁环（2）外周环形的微通道腔体（15）；磁环（2）由多个钕铁硼材质永磁立方体按海尔贝克阵列方式排列组成，磁环（2）底部设置有磁环托盘（12），磁环托盘（12）通过中心轴传动方式实现圆周转动；微通道腔体（15）具有始端和末端；始端分叉并设置有外侧入口（17）和内侧入口（18），外侧入口（17）导入循环肿瘤细胞和免疫细胞（CD45+）‑人CD45抗体‑磁颗粒复合物的细胞悬液，内侧入口（18）导入PBS缓冲液；末端分叉并设置有外侧出口（20）和内侧出口（19），内侧出口（19）导出免疫细胞（CD45+）‑人CD45抗体‑磁颗粒复合物，外侧出口（20）导出循环肿瘤细胞。
【技术特征摘要】
1.分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：所述装置包括微通道芯片（1），微通道芯片（1）包括中央的磁环（2）和磁环（2）外周环形的微通道腔体（15）；磁环（2）由多个钕铁硼材质永磁立方体按海尔贝克阵列方式排列组成，磁环（2）底部设置有磁环托盘（12），磁环托盘（12）通过中心轴传动方式实现圆周转动；微通道腔体（15）具有始端和末端；始端分叉并设置有外侧入口（17）和内侧入口（18），外侧入口（17）导入循环肿瘤细胞和免疫细胞（CD45+）-人CD45抗体-磁颗粒复合物的细胞悬液，内侧入口（18）导入PBS缓冲液；末端分叉并设置有外侧出口（20）和内侧出口（19），内侧出口（19）导出免疫细胞（CD45+）-人CD45抗体-磁颗粒复合物，外侧出口（20）导出循环肿瘤细胞。2.根据权利要求1所述的分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：磁环（2）的各个磁体的径向磁场相互迭加，构成磁环外侧强磁场强度的磁场，磁环（2）处于微通道腔体（15）的内侧同心圆之上。3.根据权利要求2所述的分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：磁环（2）底部的磁环托盘（12）中心设置有轴承和传动轴（13），传动轴（13）上设置有传动齿轮（3），传动齿轮（3）与步进电机（4）的主动齿轮啮合，从而实现步进电机（4）对磁环托盘（12）转动的控制。4.根据权利要求3所述的分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：微通道腔体（15）的外侧入口（17）和内侧入口（18）分别通过导管（7）连接注射器（9）；注射器（9）安装于注射泵（5），注射泵（5）通过螺纹转轴（10）由步进电动机（11）控制。5.根据权利要求4所述的分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：微通道腔体（15）的外侧出口（20）和内侧出口（19）分别通过导管（7）连接收集管（6）。6.根据权利要求5所述的分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：微通道芯片（1）中心具有上下贯通的圆形空腔（16），磁环托盘（12）呈圆形并嵌于空腔（16）内。7.根据权利要求6所述的分选富集数量极稀少循环肿瘤细胞的装置，其特征在于：微通道芯片（1）中心的空腔（16）外周设置环形的微通道腔体（15），微通道腔体（15）底部外...
【专利技术属性】
技术研发人员：向安，卢兹凡，薛梅，郭晏海，汪钦，叶子晨，王文文，汪莉，张旺倩，王舒宁，张阔，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61
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