两步法筛选线粒体疾病药物制造技术

本发明专利技术公开了一种两步法筛选线粒体疾病药物，涉及线粒体相关技术领域，具体而言，该方法筛选出2,3,5,4’‑四羟基二苯乙烯‑2‑O‑β‑D‑葡萄糖苷作为能够治疗线粒体疾病的药物。本发明专利技术公开了这些化合物的新用途，为治疗线粒体疾病提供了新的可能性。

Two-step screening of drugs for mitochondrial diseases

【技术实现步骤摘要】
两步法筛选线粒体疾病药物
本专利技术涉及线粒体相关
，具体而言，涉及两步法筛选线粒体疾病药物。
技术介绍
线粒体功能障碍特别是氧化磷酸化缺陷导致的一系列临床表型多样性疾病统称为线粒体疾病，保守估计其发病率约为1/6500。狭义的线粒体疾病特指mtDNA突变导致的遗传性疾病，主要累及心脏、脑、骨骼肌等高能量需求的组织和器官。线粒体疾病通常呈现遗传异质性和临床异质性，目前尚欠缺特异和有效的治愈手段。线粒体不仅是细胞能量代谢的重要场所，而且与细胞凋亡、活性氧(ROS)产生和Ca2+稳态等密切相关。线粒体功能受核基因(nDNA)和线粒体基因(mtDNA)共同调控，约1500种线粒体蛋白质中，绝大部分由核基因编码，mtDNA仅编码13种线粒体电子传递链复合体亚基、22种tRNA和2种rRNA。自1988年Wallace等报道m.11778G>A突变是Lerber氏遗传性视神经病(LHON)的重要致病因素以来，迄今已发现数百种疾病相关的mtDNA突变。这些线粒体疾病主要包括：线粒体肌病、线粒体脑病、线粒体心肌病、聋病、视神经病、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征(MELAS)，肌阵挛癫痫和破碎红纤维病(MERRF)等多种临床表型，还与一些代谢疾病(如原发性高血压、糖尿病、高胆固醇血症等)，神经退行性疾病(如帕金森症、阿耳茨海默症等)和肿瘤(如前列腺癌、乳腺癌等)的易感性相关。线粒体疾病的遗传异质性和临床异质性主要表现为同一种mtDNA突变可以引发不同的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。因此，线粒体疾病的诊断和治疗存在困难。药物筛选是指对可能具有药用价值的物质进行初步药理活性的检测和试验。传统的以靶点为中心的药物发现一直是制药行业的主流。但是解析疾病相关的药物靶点并不容易，由于存在补偿机制和反馈途径，那些在非细胞体系有效的靶点到了复杂的细胞环境中，其药物的靶向性和药效可能大大降低。这种基于靶点的药物发现过程通常漫长而昂贵。近年来，基于疾病模型的表型药物筛选重新走入人们的视野，并越来越受到大家的广泛重视。由于每个哺乳动物细胞含有数百甚至数千个双层膜结构的线粒体，每个线粒体含有多拷贝数mtDNA分子，至今还没有一种特异和高效的遗传操作系统可以对mtDNA进行定点突变或修饰。线粒体疾病的细胞模型和动物模型等构建仍困难重重。利用患者外周血淋巴细胞或成纤维细胞，及其衍生的转线粒体细胞模型，是线粒体疾病研究领域的常规方法；由患者体细胞重编程得到的疾病特异性iPSCs及其定向分化细胞被认为是一种新的疾病细胞模型。目前，已知的线粒体疾病药物筛选都为单一模型策略。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种化合物在制备治疗线粒体疾病药物中的应用，该化合物为2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，本专利技术公开了该化合物的新用途，也为治疗线粒体疾病提供了新的可能性。本专利技术的第二目的在于提供一种治疗线粒体疾病的药物，为治疗线粒体疾病提供更广的途径，以优化现有的治疗手段。本专利技术的第三目的在于提供一种治疗线粒体疾病药物的筛选方法，该筛选方法以线粒体功能筛选为基础，细胞表型筛选为辅，能够有效快速地筛选出针对线粒体疾病且药效显著的药物，具有高效率和低成本的优点。本专利技术是这样实现的：本专利技术提供了化合物在制备治疗线粒体疾病药物中的应用，具体地，化合物为2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其结构式如式1所示：2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷来源于何首乌。目前，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷已知的用途为治疗动脉粥样硬化、脂代谢、血管和心脏重塑、血管纤维化、心脑缺血、学习和记忆障碍、神经炎症、阿尔茨海默病和帕金森病、糖尿病并发症、毛发生长等。在本申请中，其用于治疗线粒体疾病。优选地，其有助于治疗母系遗传性肥厚型心肌病。本专利技术还提供了一种治疗线粒体疾病的药物，其包括有2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。优选地，该线粒体疾病是指m.2336T>C突变相关母系遗传性肥厚型心肌病。此外，本专利技术还提供了一种治疗线粒体疾病药物的筛选方法，其包括采用患者特异性转线粒体模型高通量筛选候选药物，然后通过患者特异性iPSCs定向分化细胞模型对所述候选药物进行第二步筛选。在本专利技术实施例中，候选药物包括有2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。进一步地，在进行高通量筛选候选药物时，选择与m.2336T>C突变相关的线粒体功能指标为参数，进一步优选地，与m.2336T>C突变相关的线粒体功能指标包括以下一个或多个指标：线粒体膜电势、ATP含量、ROS水平和/或氧耗速率；优选地，在进行所述第二步筛选时，以与线粒体疾病相关的病例生理的细胞表型指标为参数，进行药物筛选；优选地，以与m.2336T>C突变相关病理生理的细胞表型指标为参数，进一步优选地，所述与m.2336T>C突变相关病理生理的细胞表型指标包括以下一个或多个指标：细胞存活率和/或心肌细胞的动作电位。优选地，在该筛选方法中，线粒体疾病特指m.2336T>C突变相关，进一步优选为肥厚型心肌病(HCM)。具体地，转线粒体模型的构建包括永生淋巴细胞系和转线粒体细胞系的，而转线粒体细胞系(Transferringmitochondriacells)是指将去除了细胞核的患者永生化淋巴细胞、或成纤维细胞等的细胞质，与缺乏mtDNA的ρo细胞进行融合、筛选，构建起核基因背景一致的核质杂合细胞。它排除了核基因的干扰，可以直接反应mtDNA突变对线粒体功能的影响。Bararow等通过对10015种小分子化合物库的筛选，发现一种溴结构域抑制剂I-BET525762A可以显著提高氧化呼吸链复合体Im.3796A>G突变(成年发病的肌张力障碍)转线粒体细胞的COX5a蛋白表达水平，使细胞免于死亡。然而，I-BET525762A是否可以改善肌张力障碍仍未可知。2017年，Lorenz等首次报道通过构建MT-ATP6基因m.9185T>C突变相关Leigh综合征特异性iPSCs及其定向分化神经前体细胞模型，高通量筛选出磷酸二酯酶5抑制剂阿凡那非(avanafil)，该药物可有效降低线粒体膜电势，提高胞内Ca2+浓度，改善患者神经前体细胞和分化神经元功能。事实上，iPSCs的构建、扩增和定向分化不仅需要训练有素的科研人员，而且试剂、耗材等十分昂贵，例如iPSCs培养基的成本就是普通培养基的60倍以上。因此，基于iPSCs及其定向分化细胞的高通量筛选无论是人力和经费都是巨大负担。本专利技术提供的筛选方法，采用患者特异性转线粒体模型高通量筛选候选药物，然后通过患者特异性iPSCs定向分化细胞模型对所述候选药物进行第二步筛选，有效降低了药物发现的成本，而且完美地将iPSCs与高通量药物筛选结合，增加药物筛选的效率和结果。本专利技术通过该筛选方法成功筛选了m.2336T>C突变相关母系遗传性肥厚型心肌病(HCM)特异性药物。肥厚型心肌病(HCM)是以左心室及室间隔不对称本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化合物在制备治疗线粒体疾病药物中的应用，其特征在于，所述化合物为2,3,5,4’‑四羟基二苯乙烯‑2‑O‑β‑D‑葡萄糖苷。

【技术特征摘要】
1.一种化合物在制备治疗线粒体疾病药物中的应用，其特征在于，所述化合物为2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗线粒体疾病为提高线粒体疾病患者细胞的线粒体膜电势。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗线粒体疾病为提高线粒体疾病患者细胞的ATP合成能力。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗线粒体疾病为降低线粒体疾病患者细胞的ROS水平。5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述线粒体疾病为由mtDNA突变引起的线粒体疾病；优选地，所述线粒体疾病为由m.2336T>C突变引起的线粒体疾病。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述线粒体疾病为m.2336T>C突变相关的母系遗传性肥厚型心肌病。7.一种治疗线粒体疾病的药物，其特征在于，所述药物包括有2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述治疗线粒体疾病为提高线粒体疾病患者细胞的线粒体膜电势；和/或所述治疗线粒体疾病为提高线粒体疾病患者细胞的ATP合成能力；和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：严庆丰，胡爽依，庄倩倩，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33