一种NHS残留的检测方法技术

本发明专利技术属于药物分析领域，具体涉及一种NHS残留的检测方法，该方法采用液相色谱检测，所述液相色谱优选亲水性液相色谱(HILIC)。本发明专利技术通过添加剂及其浓度、流动相pH、溶剂、柱温、洗脱方式等多个条件的筛选与优化，最终得到了较好的分离效果。本发明专利技术的NHS液相检测方法，不同于一般的反相分离模式，样品无需进行柱前特殊处理，操作简单快捷，准确度高，灵敏度高，能够满足药物质量控制需求。

A Method for Detecting NHS Residues

【技术实现步骤摘要】
一种NHS残留的检测方法
本专利技术属于药物分析领域，具体涉及一种NHS残留的检测方法，更具体的是一种NHS残留的液相色谱检测方法。
技术介绍
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)是一种重要的有机合成中间体，在医药生产领域中应用广泛，同时也可以用于合成丁胺卡那霉素、放射性药物的标记、制造生物医学材料。NHS也是一种生物相容性较好的新型交联剂，可用作胶原、明胶等三维网状结构的生成，其交联效率高，交联较为稳定，毒性低，近年来越来越受到关注。交联工艺完成后，交联剂本身的残留定量检测是个亟待解决的问题，但目前NHS残留含量的检测方法并不成熟，如本专利技术前期尝试了反相色谱法和体积排阻色谱法，发现均不能满足检测需求，故急需寻找到一种高效、精准的NHS残留检测方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于填补现有技术空白，提供一种新的准确、快速、可靠和高灵敏度的NHS残留的液相检测方法。本专利技术首先提供了一种NHS残留的检测方法，该方法采用液相色谱检测，所述液相色谱优选亲水性液相色谱(HILIC)。优选的，所述液相色谱检测方法以键合了酰胺基团的亚已基桥杂化颗粒(BEH)为固定相。优选的，所述液相色谱检测方法中流动相由pH值为9.0的10mM乙酸铵溶液和乙腈组成。优选的，所述液相色谱检测方法中检测波长为265nm。优选的，所述液相色谱检测方法中流速为0.2ml/min。优选的，所述液相色谱检测方法中柱温为30℃。优选的，所述液相色谱检测方法中洗脱方式为等度洗脱。优选的，所述液相色谱检测方法检测时，配制NHS的标准品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，绘制NHS的标准曲线；供试品按照相同的检测条件进行检测，根据标准曲线计算供试品中NHS的含量。本专利技术的NHS液相检测方法，不同于以往的反相分离模式，样品无需进行柱前特殊处理，操作简单快捷，准确度高，灵敏度高，能够满足日常检测需求。附图说明图1反相色谱法NHS的出峰情况；图2不同乙腈含量下NHS的出峰情况；图3体积排阻色谱法NHS的出峰情况；图4不同流动相下NHS的出峰情况；图5不同溶剂条件下NHS的出峰情况；图6不同pH条件下NHS的出峰情况；图7全波长扫描；图8不同乙酸铵浓度下NHS的出峰情况；图9不同柱温下NHS的出峰情况；图10不同洗脱方式下NHS的出峰情况，其中a为梯度洗脱色谱图；b为等度洗脱色谱图；图11不同浓度NHS液相检测图谱中峰面积和对应浓度的标准曲线。具体实施方式实施例1比较实施例NHS的检测方法较少，而专利技术人也尝试了多种检测方法，均未能取得理想的效果，其中以反相色谱法和体积排阻色谱法为例做如下说明：1.1反相色谱法检测NHS仪器：品牌型号：WatersAcquityUPLCHclass；bioQuaternarysolventManager；BioSampleManager-FTN；PDADetector；Empower3.0数据处理软件色谱柱：WatersBEHC18，1.7μm，2.1×50mm流动相：20mMpH6.5磷酸缓冲液：乙腈＝95:5(V/V)流速：0.2mL/min，检测波长210nm，进样量10μL，样品池温度10℃，色谱柱温25±5℃。结果如图1所示，从图中可以看出NHS较早的洗脱至柱外，在色谱柱上无保留。故对流动相进行调整，降低有机相的比例，结果如图2所示，发现即使调整了流动相中有机相的比例，NHS仍难以在色谱柱上有所保留。1.2体积排阻色谱法检测NHS仪器：品牌型号：WatersAcquityUPLCHclass；bioQuaternarysolventManager；BioSampleManager-FTN；PDADetector；Empower3.0数据处理软件色谱柱：ACQUITYUPLCBEH125SEC1.7μm，4.6mm*300mm流动相：含10％含异丙醇(V/V)的20mMpH7.5磷酸盐缓冲液流速：0.2mL/min，检测波长265nm，进样量10μL，样品池温度10℃，色谱柱温25±5℃。结果如图3所示：在该条件下，NHS峰形较差，不利于后续的含量的测定。2.在尝试了多种检测方法和不同条件摸索，均未得到理想的分离效果后，专利技术人偶然间尝试了亲水作用色谱(HILIC)，却取得了理想的检测效果。通过实验，对比反相(RP)和亲水作用色谱(HILIC)两种不同分离模式对NHS的保留时间的影响，结果见表1(流速等条件参见上述反相色谱法)：表1不同分离模式对NHS保留时间的影响RP分离中无保留的NHS在HILIC分离模式下，保留时间明显增加，为NHS含量的检测提供一个新的思路。故继续针对HILIC的分离，对其色谱条件进行筛选和优化，以得到更优的峰形。2.1流动相添加剂的选择比较了三种流动相条件(①A:含0.1％TFA的水溶液，B：含0.1％TFA的乙腈溶液；②A:水，B：乙腈；③A:含10mMpH9.0的乙酸铵水溶液；B：含10mMpH9.0的乙酸铵乙腈溶液)，并按以下梯度洗脱，出峰情况见图4，时间(min)流速(ml/min)％A％B00.259550.2595200.2505020.010.2595250.2595从上述实验结果可以发现，当流动相中添加乙酸铵时，即流动相为A:含10mMpH9.0的乙酸铵水溶液；B：含10mMpH9.0的乙酸铵乙腈溶液时；样品在色谱柱上的保留增强，分离效果更佳。2.2样品溶剂的选择根据上述优化的流动相条件，考察不同溶剂条件下NHS的出峰情况如图5所示，从图中可见NHS用水稀释溶解时，由于水的极性较强，峰形扭曲，而改用有机相(含10mMpH9.0的乙酸铵乙腈溶液)作为溶剂时，峰形明显改善。2.3流动相pH的选择根据上述优化的流动相条件下，考察不同pH对出峰的影响。如图6所示，pH为9.0时，峰形和分离度相对更好。2.4检测全波长的确定根据上述优化的流动相条件下，对NHS样品进行全波长扫描，结果如图7及图5所示，结果表明，15.366min处为溶剂峰，9.058min处为NHS的出峰，故确定265nm为NHS的最大吸收波长，检测波长更改为265nm。2.5添加剂浓度的选择根据上述优化的流动相条件下，考察不同乙酸铵浓度对出峰的影响。从图8可以看出，添加剂乙酸铵浓度过低或过高不仅会引起保留时间的变化，同时也导致峰形变差，乙酸铵浓度为10mM时峰形较好。2.6柱温的选择根据上述优化的流动相条件下，考察不同柱温对出峰的影响。从图9可以看出，提高柱温，保留时间不断前移，也会导致主峰变歪，同时考虑较高的柱温会影响色谱柱的使用寿命，故而选择30℃的柱温。2.7洗脱方式的选择根据上述优化的流动相条件下，比较了以下两种洗脱方式对保留时间的影响：(1)梯度洗脱：A:含10mMpH9.0的乙酸铵水溶液；B:含10mMpH9.0的乙酸铵乙腈溶液时间(min)流速(ml/min)％A％B00.259550.2595200.2505020.010.2595250.2595(2)等度洗脱：含pH9.010mM乙酸铵的95％的乙腈溶液将100mMNHS标准品溶液用流动相稀释至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM的梯度标准品溶液进样，结果如下：如图10所示，梯度洗脱时，随着进样次数，保留时间不断前移，出峰不稳定；等度洗脱时，保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NHS残留的检测方法，该方法采用液相色谱检测，所述液相色谱为亲水性液相色谱。

【技术特征摘要】
1.一种NHS残留的检测方法，该方法采用液相色谱检测，所述液相色谱为亲水性液相色谱。2.如权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱检测方法以键合了酰胺基团的亚已基桥杂化颗粒为固定相。3.如权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱检测方法中流动相由pH值为9.0的10mM乙酸铵溶液和乙腈组成。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，颜莎，赵佳，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32