一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素K2的方法技术

一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素K2的方法，包括下列步骤：步骤1：以pKD46质粒为模板，以Up‑AmpR‑F和AmpR‑Down‑R为引物，通过PCR获得包含有同源臂的重组片段；步骤2：构建纳豆芽孢杆菌的感受态细胞，将步骤1获得的包含有同源臂的重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细胞内，诱导同源重组；步骤3：以氨苄青霉素作为筛选压力，挑选阳性克隆；步骤4：以Verify‑F和Verify‑R为引物，通过PCR确定所述阳性克隆的真实性；步骤5：以氨苄青霉素为培养压力，对阳性克隆进行驯化培养获得纳豆芽孢杆菌工程菌。本发明专利技术以清夜进行发酵，具有生产效率高的优点。

Construction of recombinant Bacillus natto and fermentation of vitamin K2

【技术实现步骤摘要】
一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素K2的方法
本专利技术涉及一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素K2的方法，属于生物工程和发酵工程

技术介绍
纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是一种可直接食用的益生菌，目前尚未发现毒副作用，被美国食品药品管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)认证为一般认为安全(GenerallyRecognizedasSafe，GRAS)类微生物。中国食用纳豆的传统已有近千年历史，上世纪八十年代科学家们发现纳豆芽孢杆菌可以分泌一种高活力的纤溶酶——纳豆激酶，能够促进人体内血栓溶解。在进入二十一世纪后，科学家发现纳豆芽孢杆菌在分泌纳豆激酶的同时还能够分泌维生素K2。进一步的研究发现，维生素K2具有良好的促凝血作用。在纳豆芽孢杆菌培养的不同阶段，其能够合成不同的产物。传统的纳豆芽孢杆菌培养会利用大量农副产品，如大豆粉、玉米粉，在培养过程中纳豆芽孢杆菌通过其分泌的纳豆激酶可以分解其中部分不溶的纤维蛋白变成可溶性蛋白并加以利用。传统的纳豆芽孢杆菌培养除了可以进行固体发酵，还可以进行液体的带渣发酵。随着发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：以pKD46质粒为模板，以Up‑AmpR‑F和AmpR‑Down‑R为引物，通过PCR获得包含有同源臂的重组片段；Up‑AmpR‑F：GTTAAAACGTTTCAGGATTTGGCCGTGACGGGGCTGAGCCAGGTTGATCCTTACCAATGCTTAAT；AmpR‑Down‑R：GACATTTCAGCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTCGCGGAACCCCTATT；步骤2：构建纳豆芽孢杆菌的感受态细胞，将步骤1获得的包含有同源臂的重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细...

【技术特征摘要】
1.一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：以pKD46质粒为模板，以Up-AmpR-F和AmpR-Down-R为引物，通过PCR获得包含有同源臂的重组片段；Up-AmpR-F：GTTAAAACGTTTCAGGATTTGGCCGTGACGGGGCTGAGCCAGGTTGATCCTTACCAATGCTTAAT；AmpR-Down-R：GACATTTCAGCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTCGCGGAACCCCTATT；步骤2：构建纳豆芽孢杆菌的感受态细胞，将步骤1获得的包含有同源臂的重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细胞内，诱导同源重组；步骤3：以氨苄青霉素作为筛选压力，挑选阳性克隆；步骤4：以Verify-F和Verify-R为引物，通过PCR确定所述阳性克隆的真实性；Verify-F：TGCCGGGACTCAGGAGCATTT；Verify-R：TCGTGTCGCTCGCCGGATTT；步骤5：以氨苄青霉素为培养压力，对阳性克隆进行驯化培养获得纳豆芽孢杆菌工程菌。2.根据权利要求1所述的重组纳豆芽孢杆菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑之明，王晗，王鹏，王丽，赵根海，刘会，方志伟，唐恒芳，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽,34