同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌,属于微生物技术领域，所述运动发酵单胞菌的生物保藏号为GDMCC60526和GDMCC60527；本发明专利技术还公开了上述运动发酵单胞菌的制备方法，其步骤包括：选取耐受乙酸的运动发酵单胞菌突变株A8‑1和耐受呋喃甲醛的运动发酵单胞菌突变株F3‑3制备原生质体，然后经过两轮原生质体电融合介导的基因组重组，再进行筛选即得，本发明专利技术的菌株可以同时耐受耐受5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛，可以用于纤维素预处理和水解液等含有呋喃甲醛和乙酸的发酵环境中生产燃料乙醇等生物基产品。

Zymomonas mobilis resistant to high concentration acetic acid and furfural at the same time, its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌、其制备方法及应用
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌、其制备方法及应用。
技术介绍
大力发展可再生能源已经成为全球应对气候变化、能源安全等全球性重大问题的共识，而纤维素乙醇作为一种可再生能源已经受到重视。然而破除木质纤维素抗降解屏障是纤维素转化为燃料乙醇的首要障碍。但在预处理过程中，一些化学预处理手段，如稀酸等，较容易形成乙酸和呋喃甲醛等一系列对微生物具有毒害左右的抑制物；其中酶解液中乙酸浓度可达1-10g/L，酶解液中呋喃甲醛的浓度可达0.5-11g/L，严重影响了后续的生物发酵过程。利用额外的脱毒工艺会增加生产成本。相比较而言，利用生物手段构建耐受呋喃甲醛和乙酸的优良微生物菌株将是抵御呋喃甲醛和乙酸毒害、降低生产成本的方法之一。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobislis)是产乙醇的优良物种，近年来在可再生燃料乙醇研究和生产中受到广泛关注，杜邦公司已经开发出利用该菌进行燃料乙醇生产的工艺生产线。然而目前在运动发酵单胞菌进行木质纤维素燃料乙醇发酵工艺中，呋喃甲醛和乙酸仍然是一个巨大的挑战。为了解决上述问题，本申请的专利技术人做了很多努力，比如专利申请号为201510150902.8的中国专利申请，公开了一种通过突变等步骤得到一种耐受3g/L的呋喃甲醛的运动发酵单胞菌ZM4-MF；又比如专利申请号为201711437348.7的中国专利申请，公开了一种通过ARTP诱变和筛选步骤得到一种耐受8g/L乙酸的运动发酵单胞菌突变株AQ8-1；但是，在发酵产乙醇的环境中，往往高浓度的乙酸和高浓度的呋喃甲醛同时存在，所以，有必要对现有的这些菌株进行进一步改进，使其能实现对高浓度的乙酸和呋喃甲醛的双重耐受。
技术实现思路
本专利技术的目的之一，就在于提供一种同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，以解决上述问题。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，所述运动发酵单胞菌的生物保藏号为GDMCC60526。另一种能同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，所述运动发酵单胞菌的生物保藏号为GDMCC60527。本专利技术的目的之二在于，提供一种上述的同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的制备方法，采用的技术方案为，包括以下步骤：(1)制备原生质体：选取一株耐受乙酸的运动发酵单胞菌突变株A8-1和一株耐受呋喃甲醛的运动发酵单胞菌突变株F3-3，分别制备突变株A8-1和F3-3的原生质体；(2)电融合：取步骤(1)所得的突变株A8-1和F3-3原生质体溶液，混合后离心；然后用缓冲液洗并重悬，取重悬细胞于电融合仪中进行电融合；(3)运动发酵单胞菌融合菌株的筛选：首先测试亲本A8-1和F3-3在各梯度乙酸和各梯度呋喃甲醛组合的双抗平板上的抗性，并同时以野生菌株ZM4为对照；通过两轮步骤(2)所述的电融合介导的基因组重组，最终筛选出10株同时耐受5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛的突变株，通过发酵测试，最终选取发酵效果最好的ZM532,ZM533作为5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛筛选菌株，生物保藏号分别为GDMCC60526和GDMCC60527，分类命名为：Zymomonasmobilis；保藏时间均为：2018年12月18日，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼。作为优选的技术方案：步骤(1)中，所述突变株A8-1耐受8g/L乙酸，所述突变株F3-3耐受3g/L呋喃甲醛。作为优选的技术方案：步骤(2)中，所述混合后的A8-1和F3-3原生质体溶液中，含有106到108个细胞，且A8-1和F3-3细胞个数相同。作为优选的技术方案：步骤(2)中，电融合时，直流电压为600-1000V，交流电压为10-60V，脉冲时间为5-40μs，脉冲次数为1-3次。作为进一步优选的技术方案：步骤(2)中，电融合时，直流电压为800V，交流电压为40V，脉冲时间为25μs，脉冲次数为3次。本专利技术所采用的耐受8g/L乙酸的运动发酵单胞菌突变株A8-1，可以选自申请号为201711437348.7的中国专利申请所公开的AQ8-1，也可以选自通过对野生运动发酵单胞菌(ZymomonasmobilisZM4)采用其他方法比如适应性进化等方法得到的耐受8g/L乙酸的其他运动发酵单胞菌突变株；本专利技术所采用的耐受3g/L呋喃甲醛的运动发酵单胞菌突变株F3-3，可以选自专利申请号为201510150902.8的中国专利申请所公开的ZM4-MF，也可以选自通过对野生运动发酵单胞菌(ZymomonasmobilisZM4)采用其他方法比如适应性进化等方法得到的耐受3g/L呋喃甲醛的其他运动发酵单胞菌突变株；本专利技术在上述两株突变菌株的基础上，通过原生质体电融合介导的基因组重组(genomeshuffling)育种方法对A8-1和F3-3进行两轮电融合法的基因组重组，最终获得同时具有乙酸和呋喃甲醛抗性的运动发酵单胞菌突变菌株。上述两株突变菌株是耐受呋喃甲醛和乙酸的优良微生物菌株，可应用在纤维素预处理和水解液等含有呋喃甲醛和乙酸的发酵环境中生产燃料乙醇等生物基产品。本专利技术的目的之三，在于提供上述的同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的应用，采用的技术方案为：将所述运动发酵单胞菌用于含有呋喃甲醛和乙酸的发酵环境中生产乙醇。作为优选的技术方案：所述含有呋喃甲醛和乙酸的发酵环境为纤维素预处理或水解液。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次将电融合技术应用于运动发酵单胞菌，将现有的单抗性运动发酵单胞菌进行基因组重组，得到具有同时耐受高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的新型运动发酵单胞菌；一方面对现有的单抗性菌株进行了改良，另一方面也丰富了双重抗性的运动发酵单胞菌库，为进一步提高运动发酵单胞菌的抗性提供了研究基础。附图说明图1为不同菌株在5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛环境下的OD600变化图；图2为不同菌株在5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛环境下的葡萄糖消耗变化图；图3为不同菌株在5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛环境下的乙醇浓度变化图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术作进一步说明。实施例1：同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的制备方法，包括以下步骤：(1)运动发酵单胞菌突变株A8-1和F3-3的原生质体制备方法，参考文献K.J.Lee,C.N.Seong,StrainDevelopmentofZymomonasmobilisforEthanolProduction-Optimalconditionsforthespheroplastformationandregeneration,(1984)，其典型的步骤包括：将5mLZM4过夜培养液转接到装有50mLRMg的150mL锥形瓶中，30℃培养至OD600～0.8(～5h)；3000g、4min离心收集菌体，用0.01MTris-HCl缓冲液(pH8.0)洗涤两次后重悬于SMM溶液(～4mlSMM,菌体浓度～6x109cells/ml)；每毫升菌液加入0.4mL的溶菌酶(3mg/ml)，37℃温浴5min后再加入0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，其特征在于：所述运动发酵单胞菌的生物保藏号为GDMCC60526。

【技术特征摘要】
1.一种同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，其特征在于：所述运动发酵单胞菌的生物保藏号为GDMCC60526。2.一种同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，其特征在于：所述运动发酵单胞菌的生物保藏号为GDMCC60527。3.权利要求1或2所述的同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备原生质体：选取一株耐受乙酸的运动发酵单胞菌突变株A8-1和一株耐受呋喃甲醛的运动发酵单胞菌突变株F3-3，分别制备突变株A8-1和F3-3的原生质体；(2)电融合：取步骤(1)所得的突变株A8-1和F3-3原生质体溶液，混合后离心；然后用缓冲液洗并重悬，取重悬细胞于电融合仪中进行电融合；(3)运动发酵单胞菌融合菌株的筛选：首先测试亲本A8-1和F3-3在各梯度乙酸和各梯度呋喃甲醛组合的双抗平板上的抗性，并同时以野生菌株ZM4为对照；通过两轮步骤(2)所述的电融合介导的基因组重组，最终筛选出10株同时耐受5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛的突变株，通过发酵测试，最终选取发酵效果最好的ZM532,ZM533作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：何明雄，王薇廷，吴波，秦晗，
申请(专利权)人：农业部沼气科学研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51