粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种粪肠球菌，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12088。并公开了其在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素的所用的培养基，并公开了具体的检测方法。本发明专利技术方法的筛检方法操作简单，可直接通过观察培养基凝固或指示剂变色判读结果，不需特殊精密仪器，可同时检测多种抗生素残留，适合食品中抗生素残留筛查，实用性强。

Detection and application of antibiotic residues in Enterococcus faecalis, its culture medium and milk

【技术实现步骤摘要】
粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用
本专利技术属于于生命科学和食品安全领域，更具体的涉及一种粪肠球菌及利用该菌株快速检测牛奶中残留抗生素的方法。
技术介绍
牛奶中抗生素残留是牛奶安全的一个重要问题。随着畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高。为预防和治疗乳房炎等疾病，抗生素类兽药在畜牧业的应用日益广泛，在应用抗生素治疗奶牛疾病在取得效果的同时，不规范使用抗生素，如加大使用剂量、延长治疗期，甚至给泌乳期奶牛长期应用抗生素预防疾病的行为，使得牛奶中往往残留有较高含量的抗生素。我国许多乳制品不符合需进口国家和地区的要求，其中抗生素残留超标是重要限制因素。牛奶中抗生素残留不仅给牛奶生产及相关产业带来损失，同时也对消费者的身体健康带来诸多潜在的危害。随着人民生活水平的提高和对生物安全和食品安全的重视，抗生素残留已成为牛奶食品安全关注的重点。为适应国内外日益严格的食品质量要求，满足市场和进出口快速通关的需要，建立一种简单、快速、有效检测牛奶中多种抗生素残留的方法具有重要意义。有关文献或方法中多种抗生素药物残留的检测方法基本上是对每一类药物进行分别检测，分析方法包括色谱法、色/质联用法、薄层色谱、免疫测定法和微生物抑制法等。我国常用磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类共5大类33种兽药的药物，其化学分子结构和化学性质差异较大，不易同时检测。同时对牛奶中多种抗生素残留进行检测有一定困难，目前我国食品卫生标准(GB/T4789.27-2008)中规定的利用微生物学方法筛检牛奶中抗生素残留的检测方法有TTC法和嗜热脂肪杆菌芽孢抑制法。其中TTC法设备简单、费用低，适合大样本的筛选和基层实验室操作而被广泛使用，该法主要检测β内酰胺类的青霉素G，以及链霉素、庆大霉素和卡那霉素。另外，国标法的检测原理和结果判断根据嗜热链球菌的生长是否被残留抗生素抑制而得，由于加入样品后在37℃培养2小时，此条件下大部分环境中的细菌(如大肠埃希菌、表皮葡萄球菌等触酶阳性的细菌)均可快速生长并引起TTC的颜色发生改变，操作过程中如出现污染则会导致出现假阴性结果。在检测青霉素和氯霉素上敏感度与枯草杆菌纸片法大致相等，但对链霉素不太敏感，对新霉素不敏感，消毒剂可干扰试验。此外，目前我国采用的国标方法不包括对四环素、红霉素、万古霉素等的检测。四环素类抗生素可以预防和治疗传染病、提高饲料效率、加快动物的生长速度，在畜牧业中得到广泛应用。在奶牛的饲养过程中，四环素常用作饲料添加剂及防治奶牛的乳腺炎，从而导致牛奶中可能有四环素残留。红霉素属于大环内酯类抗生素，也被广泛用于畜、禽、水产养殖中，食品安全领域主要采用仪器法来分析动物源性食品中红霉素的残留量。万古霉素属于糖肽类抗生素，其分子中含有糖及肽链结构，可有效治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)引起的感染，特别是对牛乳腺炎等疾病有较好的疗效。目前日本规定牛奶中万古霉素的限量为10ug/kg,美国禁止在进口动物源性食品中使用糖肽类抗生素,我国农业部第560号公告规定万古霉素为禁用兽药。随着MRSA和MRSE的感染越来越常见，其他药物疗效甚微的情况下，万古霉素等糖肽类药物在奶牛疾病治疗上的的非法使用将不可避免。微生物抑制法操作简便，仪器设备和人员要求均不高，样品前处理简单，检测时间短等特点，一直被用于大批量样品的过筛。本专利技术主要应用对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类敏感的益生菌，建立一种快速筛检和定量检测四环素、青霉素、庆大霉素、红霉素、万古霉素、氯霉素的微生物抑制法。
技术实现思路
1、专利技术目的。本专利技术筛选出一株对抗生素敏感的粪肠球菌，并由此建立一种简单、快速、灵敏的以该菌株为工作菌株进行牛奶中抗生素残留检测的筛检方法。2、本专利技术所采用的技术方案。本专利技术的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，于2016年2月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，保藏编号为12088。本专利技术的粪肠球菌菌株具有以下微生物学特征：(1)菌落形态：粪肠球菌CGMCCNo.12088在TPY固体平板上的菌落直径1.2-1.5mm、圆形、凸起、边缘整齐、乳白色、不透明，具有光泽，质地柔软、细腻；在LB固体培养基上的菌落直径5.0-12mm、圆形、凸起、边缘整齐、乳白色或灰白色、不透明，具有光泽，质地柔软、细腻，易乳化；(2)菌体形态：革兰染色阳性球菌，菌体圆形或椭圆形，大多呈双或散在排列，无荚膜，无芽胞。(3)生理生化特征：触酶阴性，发酵半乳糖、蔗糖、L-阿拉伯糖，不发酵果糖、麦芽糖、木糖，不还原尿素，硝酸盐还原实验、靛基质实验阴性。(4)培养特征：有氧、厌氧均生长良好。最适生长温度37℃-42℃，最低生长温度15℃，最高生长温度45℃；最适pH7.0-7.5，pH低于6.0或高于9.0生长不佳。并公开了上述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的应用。上述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素的培养基配方，其配方和配制步骤为：配制配方1：蛋白胨30g，酵母提取物30g，牛肉浸膏10g，可溶性淀粉1.0g，葡萄糖40g，氯化钠10g，K2HPO46g，KH2PO46g，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH至7.0-7.5，包装后121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用；配制配方2：称取优质黄豆粉200g，溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮沸30分钟后，用多层纱布及定性滤纸过滤；配制配方3：取150mL按配方2配制的滤液，加入50mL按配方1配制的液体，调节pH至7.0-7.2，121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用。本专利技术还公开了一种牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素的检测方法，包括以下步骤：(1)菌株活化：将上述的粪肠球菌菌株接种于LB固体培养基，40℃-42℃培养18-24h；(2)菌悬液制备：取步骤(1)所得的粪肠球菌单个菌落，用无菌生理盐水，调节OD600nm为0.10-0.12的菌悬液；吸取0.1ml菌悬液加入到按配方3配制的9.9ml培养基中，42℃培养过夜。过夜培养物可4℃保存。(3)取过夜培养物，用无菌生理盐水配制成1:10的工作用菌悬液，临用新配；(4)无抗奶制备：称取10g-12g无抗奶粉，用无菌蒸馏水配制成10％-12％的溶液；或用蒸馏水溶解后121℃高压灭菌15-30分钟，4℃保存，备用。(5)标准管制备：取四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素标准储备液，用无抗奶稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；四环素300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的标准工作液；红霉素160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L；氨苄青霉素20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液；庆大霉素800μg/L、40本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种粪肠球菌，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12088。

【技术特征摘要】
1.一种粪肠球菌，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12088。2.权利要求1所述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的应用。3.权利要求1所述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的培养基配方，其配制步骤为：配制配方1：蛋白胨30g，酵母提取物30g，牛肉浸膏10g，可溶性淀粉1.0g，葡萄糖40g，氯化钠10g，K2HPO46g，KH2PO46g，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH至7.0-7.5，包装后121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用；配制配方2：称取优质黄豆粉200g，溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮沸30分钟后，用多层纱布及定性滤纸过滤；配制配方3：取150mL按配方2配制的滤液，加入50mL按配方1配制的液体，调节pH至7.0-7.2，121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用。4.一种牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的检测方法，包括以下步骤：(1)菌株活化：将权利要求1所述的粪肠球菌菌株接种于LB固体培养基，40℃-42℃培养18-24h；(2)菌悬液制备：取步骤(1)所得的粪肠球菌单个菌落，用无菌生理盐水，调节OD600nm为0.10-0.12的菌悬液；吸取0.1ml菌悬液加入到按配方3配制的9.9ml培养基中，42℃培养过夜，过夜培养物置于4℃保存；(3)取过夜培养物，用无菌生理盐水配制成1:10的工作用菌悬液，临用新配；(4)标准管制备：取四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素标准储备液，用pH8.0磷酸盐缓冲液稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；四环素300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜季梅，刘佳明，楼永良，叶盛，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33