一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法技术

本发明专利技术公开了一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法，包含如下步骤：1)样品前处理：采用有机溶剂沉淀法处理沼液以净化样品并提取目标物；2)检测：通过高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法


[0001]本专利技术涉及一种测定沼液中氨基酸含量的方法，具体涉及一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法。

技术介绍

[0002]沼液利用难是制约沼气技术高效推广最重要的因素，是限制沼气工程发挥绿色循环和碳减排效益的最大阻碍。沼液市场化推广难的一大制约因素是营养物质和风险因子标准化困难，检测方法缺失。目前，沼液中氮、磷、钾、有机质等常规营养物质关注较多，方法较成熟，而沼液中氨基酸关注较少，标准缺失，检测方法未建立。
[0003]沼液中含有丰富的氨基酸如缬氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸等，不同发酵原料、不同发酵工艺的沼液中氨基酸组成成分及含量有所不同，对不同类型沼液中氨基酸种类及含量准确分析有利于沼液肥资源化利用。
[0004]常见的氨基酸检测仪器有高效液相色谱仪、离子交换色谱仪、全自动氨基酸分析仪。其中全自动氨基酸分析仪检出限较高，离子交换色谱仪、高效液相色谱仪都需要柱前衍生，衍生剂成本较高且具有一定毒性，检测时靠保留时间定量，受色谱柱分离度的影响大，检测时间较长，精密度低，不利于大批量样品的检测。LC
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MS
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MS仪测定氨基酸样品前处理简单，提取剂对人体危害较小，且可以同时测多种氨基酸，具有检出限低、准确度高、精密度高等优点。开发一种基于LC
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MS
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MS法检测沼液中氨基酸，为精确分析沼液中氨基酸组分提供技术手段。
[0005]目前一些学者对沼液中的氨基酸的研究受限于标准方法的缺失，仅针对沼液中总氨基酸含量和游离氨基酸含量进行了测定，而对不同原料沼液中具体氨基酸的种类及含量分析较少。氨基酸测定方法较多，有薄层层析法、离子色谱法、液相色谱法和气相色谱法等，但由于色谱法检测时仅靠保留时间定量，检测效率和精确度受限于色谱柱分离度和流动相，一般仅适用于分析比较洁净的样品。而沼液呈黑色，有许多细小固体悬浮物，离心分离很难得到上清液和沉淀，加上干扰组分较多，用一般的方法测定其中的氨基酸比较困难。
[0006]因此，有必要建立一种新的处理方法，结合仪器方法的优化，实现对沼液基质中多种氨基酸的高通量定量检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种沼液中氨基酸的检测方法，通过对沼液的预处理，结合液质联用进行检测，为解决沼液中的干扰组分较多而导致沼液中的氨基酸含量检测困难的问题，能适用于测定氨基酸种类复杂多样的沼液样品。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法，包含如下：
[0009]1)样品前处理：取沼液，吸取乙腈添加到待测沼液样品中用于沉淀待测沼液样品中的蛋白质，将所得混合溶液震荡并超声，在4℃、5000rpm条件下低温离心获得上清液；将
离心所得沉淀按上述步骤重复提取2次，合并所得上清液，并30℃水浴中旋转蒸干；加入体积分数为0.1％甲酸的20％甲醇水，涡旋溶解，再加入正己烷涡旋，离心后取下层水相过0.22μm滤膜后制得待测样品；
[0010]2)检测：配制氨基酸标准品，采用高效液相色谱
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串联质谱联用仪对配制的氨基酸标准品进行氨基酸检测，用峰面积对浓度制作标准曲线，并对步骤1)中制备的的待测样品进行氨基酸检测；
[0011]3)定量分析：将上述待测样品的各待测成分峰面积与其对应的标准曲线相比较，计算得到待测样品中各待测成分的浓度，即得待测沼液样品中各待测成分的含量。
[0012]优选地，上述检测方法中的步骤1)样品前处理中添加的乙腈与沼液的质量体积比为沼液:乙腈＝1:4。
[0013]优选地，上述检测方法中的步骤2)检测中的氨基酸标准品分别为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和丙氨酸标准品，每种氨基酸分别配制1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的浓度。
[0014]优选地，上述检测方法中的步骤2)中的氨基酸检测的条件包含如下：
[0015]其液相色谱条件为：色谱柱为岛津Shim
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pack GIST
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HP C18
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AQ，流动相A为甲醇，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.6mL/min，进样量为10μL。
[0016]质谱条件为：采用正离子模式扫描，在多反应监测模式下对目标物进行定量分析。
[0017]优选地，上述的梯度洗脱的条件设置为如下所示：
[0018]0min时，流动相A的体积百分数为5％，流动相B的体积百分数为95％，流速为0.6mL/min；
[0019]2～3min时，流动相A为95％，流动相B为5％，流速为0.6mL/min；
[0020]4～10min时，流动相A为5％，流动相B为95％，流速为0.6mL/min。
[0021]优选地，上述检测方法中的色谱柱的柱温为40℃。
[0022]优选地，上述检测方法中的质谱条件，其电喷雾离子源条件为：喷雾电压为正离子3500V、负离子2500V，离子源温度为400℃，鞘气压力35Arb，辅气压力为10Arb，离子吹扫气体压力为0Arb。
[0023]本专利技术提供的上述任意一种液质联用检测方法均可被用于沼液中氨基酸的含量测定。
[0024]本专利技术的一种沼液中氨基酸的检测方法，解决了沼液中的干扰组分较多而导致沼液中的氨基酸含量检测困难的问题，具有以下优点：
[0025]本专利技术的检测方法首次建立了沼液样品中氨基酸液相色谱串联质谱检测法，能够有效检出沼液样品中的赖氨酸、亮氨酸、酪氨酸等多种氨基酸，分离效果好，灵敏度高，选择性强，准确性好。
[0026]本专利技术的检测方法采用蛋白质有机溶剂沉淀法对沼液样品进行前处理，可有效的消除沼液中复杂基质的干扰，基线平稳，不发生漂移，复溶后加入正己烷能除去脂肪的干扰，而未经净化的沼液样品存在极强的干扰成分使目标成分无法检出。
[0027]本专利技术的检测方法检测时间短，只需10min即可完成检测过程，大大提高了检测效率，适合高通量筛选。
[0028]本专利技术的检测方法具有良好的线性关系，R2>0.997，定量检测的准确度高，重现性
好，具有良好的精密度。
附图说明
[0029]图1为本专利技术中的精氨酸标准品的LC
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MS
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MS图。
[0030]图2为本专利技术中的赖氨酸标准品的LC
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MS
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MS图。
[0031]图3为本专利技术中的谷氨酸标准品的LC
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MS
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MS图。
[0032]图4为本专利技术中的亮氨酸标准品的LC
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MS
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MS图。
[0033]图5为本专利技术中的酪氨酸标准品的LC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法，其特征在于，包含：1)样品前处理：取沼液，吸取乙腈添加到待测沼液样品中，将所得混合溶液震荡并超声，离心后取上清液；将上清液于30℃水浴中旋转蒸干；加入体积分数为0.1％甲酸的20％甲醇水，涡旋溶解，再加入正己烷涡旋，离心后取下层水相过0.22μm滤膜后制得待测样品；2)检测：配制氨基酸标准品，采用高效液相色谱
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串联质谱联用仪对配制的氨基酸标准品进行氨基酸检测，用峰面积对浓度制作标准曲线，并对步骤1)中所述的待测样品进行氨基酸检测；3)定量分析：将步骤2)所述待测样品的各待测成分峰面积与其对应的标准曲线相比较，计算得到待测样品中各待测成分的浓度，即得待测沼液样品中各待测成分的含量。2.根据权利要求1所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤1)样品前处理中添加的乙腈与沼液的质量体积比为沼液:乙腈＝1:4。3.根据权利要求1所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤1)采用乙腈沉淀待测沼液样品中的蛋白质，在4℃、5000rpm条件下低温离心获得所述上清液。4.根据权利要求1所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤2)检测中的氨基酸标准品分别为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和丙氨酸标准品
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每种氨基酸分别配制1μmol/L、2μmol/L、5μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刈，刘于嘉，冉毅，龙玲，陈佳，
申请(专利权)人：农业部沼气科学研究所，
类型：发明
国别省市：