超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法技术

本发明专利技术提供了一种超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法，包括如下步骤：将待测蛋白质溶液使用超滤管进行超滤，使蛋白质截留在超滤管内，向超滤管中加入碳酸氢铵缓冲液，将超滤管中的蛋白质溶液置换为碳酸氢铵缓冲液，然后加入蛋白酶，酶解后收集滤液，将滤液加热后即得到多肽样品。本发明专利技术所述的超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法利用超滤管截流蛋白，将酶解的缓冲液置换成碳酸氢铵水溶液，酶解后利用碳酸氢铵加热潮解的特性除去多肽溶液中的碳酸氢铵成分，最终得到纯净的多肽，可以方便地与LC

【技术实现步骤摘要】
超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法


[0001]本专利技术属于生化分析领域，尤其是涉及一种超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法。

技术介绍

[0002]蛋白质组学是后基因组时代的产物。基因需要依赖于转录和翻译后后的产物蛋白质行使功能。基因组是固定不变的，而蛋白质组会响应环境的变化。因此，同一生物在生物体不同部位、生命的不同时期以及不同的环境中，具有不同的蛋白质表达。人类基因组测序计划的完成并没有给人提供解开生命的密钥，科学家把兴趣转到蛋白质，希望通过蛋白质组的研究来进一步解开生命的本质。
[0003]通过高效液相串联质谱对生物系统中全蛋白进行定性定量，已经成为一种主流的分析工具。目前鸟枪法是蛋白质组学分析应用最广的分析策略。该方法先将蛋白酶解成肽段，然后通过色谱分离肽段混合物，再用质谱的电喷雾电离(ESI)技术将肽段碎裂，根据碎裂谱图的离子峰信息进行数据库搜索来鉴定肽段，最后将鉴定的肽段进行组装、重新归并为蛋白。
[0004]电喷雾电离具体包括以下几个过程：样品首先通过一个毛细管喷针被喷出来，进入质谱仪，在喷针的外面用鞘气加热样品，辅助样品的雾化。加热雾化过程中溶液中的流动相或者溶剂挥发，剩下的气态离子在毛细管喷针尖端被电离。这些离子在质谱仪入口处被真空抽到质谱仪里，电场驱动进入质谱仪进行分子量的检测。
[0005]一般来说，电喷雾质谱法对盐类的容忍度较低。一方面是因为小分子盐类在电喷雾系统中存在较强的竞争性电离效应，从而导致强烈的离子抑制效应，使待测物的灵敏度明显降低。其次，盐类的存在会产生一系列的离子加成峰，这使得谱图的解析变得复杂。此外，过多的盐分会腐蚀和污染质谱系统的硬件，严重时导致硬件损坏，需要及时清洗。因此，蛋白组学样品前处理过程中，脱盐步骤是非常必要的。
[0006]为减少机器的损坏，并且提高检测灵敏度，上机前一般都会要求对蛋白组学样品脱盐处理。碳酸氢铵是蛋白组学样品前处理中最常用到的一种盐，50mM碳酸氢铵水溶液可以提供酶解过程需要的弱碱性环境。然而，碳酸氢铵在酶解过程中大量存在，容易影响后续质谱分析。目前脱盐常用的方法是反相C18树脂脱盐柱法。脱盐柱法分为结合、清洗、洗脱三步。首先，利用疏水相互作用，多肽在高水相流动相中与反相柱结合。然后，使用水反复清洗盐和缓冲液。最后，用有机溶剂破坏多肽与C18的结合，洗脱多肽。然而，该方法存在一系列的弊端，比如多肽对C18吸附性有差异，包括磷酸化多肽在内的亲水性比较强的多肽可能不能与C18树脂很好地结合，会造成结合阶段的样品损失，而疏水性强的多肽与C18树脂结合牢固，洗脱阶段却难以洗脱下来，所以亲水性强的多肽和疏水性强的多肽都会在脱盐柱脱盐过程中损失，进而导致样品的选择性偏好，会损坏质谱结果的客观性。而且，最终多肽样品上机前需要在0.1％甲酸溶液中溶解，因此，有机溶剂洗脱后的多肽不能很好的与LC
‑
MS衔接，还需真空离心干燥去除有机溶剂。使用有机溶剂洗脱样品可能会造成样品的PEG聚合
物污染，导致质谱峰偏移。这些问题导致脱盐柱脱盐后的蛋白组学样品重复性差、检出蛋白质种类低问题，因此亟需一种脱盐柱脱盐的替代方法。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，提出一种超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法。
[0008]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0009]一种超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法，包括如下步骤：
[0010]将待测蛋白质溶液使用超滤管进行超滤，使蛋白质截留在超滤管内，向超滤管中加入碳酸氢铵缓冲液，将超滤管中的蛋白质溶液置换为碳酸氢铵缓冲液，然后加入蛋白酶，酶解后收集滤液，将滤液加热后即得到多肽样品。
[0011]进一步，所述的超滤管的滤膜孔径为3
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300KD；优选的，所述的超滤管的滤膜孔径为10
‑
50KD。
[0012]进一步，将待测蛋白质溶液经过还原和烷基化反应后进行所述的步骤(1)中的超滤步骤；将待测蛋白质溶液进行3
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5次离心超滤后进行酶解。还原和烷基化有利于后续酶解反应的进行。
[0013]进一步，所述的碳酸氢铵缓冲液为浓度为5
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500mM碳酸氢铵水溶液；优选的，所述的碳酸氢铵缓冲液为浓度为50
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100mM碳酸氢铵水溶液。
[0014]进一步，所述的碳酸氢铵缓冲液中包含有浓度为0.002
‑
0.1％的蛋白酶增强剂；所述的蛋白酶增强剂为ProteaseMAX
TM
Surfactant(Promega)。
[0015]进一步，所述的蛋白酶为质谱级蛋白酶；所述的蛋白酶为切割位点具有特异性的内肽酶中的至少一种。
[0016]进一步，所述的蛋白酶为ArgC蛋白酶、AspC蛋白酶、AspN蛋白酶、Chymotrypsin蛋白酶、D.P蛋白酶、GluC蛋白酶、GluN蛋白酶、LysC蛋白酶、LysC/P蛋白酶、LysN蛋白酶、Trypsin蛋白酶或Trypsin/P蛋白酶的中的至少一种；优选的，所述的蛋白酶为Trypsin蛋白酶和/或LysC蛋白酶。
[0017]进一步，所述的酶解步骤的时间为5分钟
‑
48小时，温度为30
‑
37.5℃；优选的，所述的酶解步骤的时间为16
‑
24小时，温度为37℃。
[0018]进一步，所述的收集滤液步骤采用离心法或者负压法进行收集；所述的离心法的离心力为5000
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20000g，时间为5分钟
‑
1小时；优选的，所述的离心法的离心力为8000
‑
15000g，时间为20分钟
‑
30小时。
[0019]进一步，所述的加热步骤的温度为大于等于60℃。
[0020]为提高除盐效率，酶解后的多肽样品可通过真空离心浓缩或者干燥，之后进行加热除盐；通过真空离心干燥样品：可提高真空离心干燥机腔温度至大于等于37℃，样品中的碳酸氢铵可在干燥过程中同时分解；通过真空离心干燥样品：待干燥后，观察管底，如有白色盐粉末，加入微量超纯水溶解白色盐，然后烘干，碳酸氢铵会在加热烘干过程中分解挥发。得到的多肽样品的除盐效果通过pH试纸检验。
[0021]除盐后，如为干燥的多肽可加入超纯水复溶，用pH试纸检测多肽样品的pH值，如pH值为中性或者弱酸性以下视为碳酸氢铵已经被去除；
[0022]除盐后，如为多肽溶液，用pH试纸检测多肽样品的pH值，如pH值为中性或者弱酸性
以下则视为碳酸氢铵已经被去除。
[0023]相对于现有技术，本专利技术具有以下优势：
[0024]本专利技术所述的超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法利用超滤管截流蛋白，将酶解的缓冲液置换成碳酸氢铵水溶液，酶解后利用碳酸氢铵加热潮解的特性除去多肽溶液中的碳酸氢铵成分，最终得到纯净的多肽，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法，其特征在于：包括如下步骤：将待测蛋白质溶液使用超滤管进行超滤，使蛋白质截留在超滤管内，向超滤管中加入碳酸氢铵缓冲液，将超滤管中的蛋白质溶液置换为碳酸氢铵缓冲液，然后加入蛋白酶，酶解后收集滤液，将滤液加热后即得到多肽样品。2.根据权利要求1所述的超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法，其特征在于：所述的超滤管的滤膜孔径为3
‑
300KD；优选的，所述的超滤管的滤膜孔径为10
‑
50KD。3.根据权利要求1所述的超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法，其特征在于：将待测蛋白质溶液经过还原和烷基化反应后进行所述的步骤(1)中的超滤步骤；将待测蛋白质溶液进行3
‑
5次离心超滤后进行酶解。4.根据权利要求1所述的超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法，其特征在于：所述的碳酸氢铵缓冲液为浓度为5
‑
500mM碳酸氢铵水溶液；优选的，所述的碳酸氢铵缓冲液为浓度为50
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100mM碳酸氢铵水溶液。5.根据权利要求4所述的超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的蛋白组学前处理方法，其特征在于：所述的碳酸氢铵缓冲液中包含有浓度为0.002
‑
0.1％的蛋白酶增强剂；所述的蛋白酶增强剂为ProteaseMAX
TM
Surfactant。6.根据权利要求5所述的超滤管辅助酶解及加热潮解除盐的...

【专利技术属性】
技术研发人员：季学猛，史爱莹，张燕，王硕，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：