一种双向激活共刺激分子受体及其用途制造技术

本发明专利技术属于细胞生物学和免疫学领域领域，涉及一种双向激活共刺激分子受体及其用途。具体地，本发明专利技术涉及一种双向激活共刺激分子受体，其从N端到C端依次包括下述元件：可选的信号肽、共刺激信号分子激活型单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内共刺激信号分子。当双向激活共刺激分子受体与包含第一信号的第一代CAR‑T共同修饰T细胞时，可以产生强烈的集群效应，杀伤肿瘤细胞。同时，这种双向激活的作用仅仅局限在相互接触的T细胞之间，不会像注射共刺激信号分子的激活型抗体一样，引发强烈T细胞免疫，造成潜在严重毒副作用。

A Bidirectional Activated Costimulatory Molecular Receptor and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种双向激活共刺激分子受体及其用途
本专利技术属于细胞生物学和免疫学领域，涉及一种双向激活共刺激分子受体，及其用该受体修饰后的T细胞治疗恶性肿瘤的用途。
技术介绍
肿瘤过继细胞治疗(adoptivecelltherapy，ACT)是将经处理的自体或异体免疫细胞(主要是自体细胞)回输给肿瘤患者，直接杀伤肿瘤细胞，或者通过激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞，达到治疗目的。当前肿瘤过继细胞治疗发展迅速，在多种恶性肿瘤的临床治疗中取得了非常好的疗效(Nature.2016；Jun16；534(7607):396-401)；(Cell.2016Oct6；167(2):405-418.e13)。肿瘤免疫细胞治疗被认为是最有前景的治疗恶性肿瘤的手段之一。T细胞活化需要两个信号的刺激，即两种T细胞活化相关信号。其中，T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；T细胞表面的共刺激分子(如CD28)与相应配体(如B7)结合，提供T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。但肿瘤细胞第一信号刺激源(如MHC分子)与第二信号配体(如B7)等缺乏或表达下降，无法有效提供T细胞活化相关的信号，从而无法激活T细胞免疫反应。而广泛性的激活T细胞共刺激分子，可能带来强烈的毒副作用。嵌合抗原受体CAR(chimericantigenreceptors，CAR)通过胞外特异性识别肿瘤抗原的单链抗体片段(SinglechainVariableFragment,scFv)，激活胞内信号CD3ζ或FcεRIγ的ITAM(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs)信号传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代与第三代的CAR是将T细胞激活所需的两个信号进行了合并，将第二信号CD28或/和4-1BB细胞内信号区域直接连接到CD3ζ分子，从而绕过了肿瘤细胞通常第二信号如B7等缺乏所引起T细胞不能激活的障碍。第一信号与第二信号合并后，大大提高了对T细胞激活、增殖及杀伤能力，使之疗效大幅度增加，基于目前对T细胞激活机制的理解，CD28、4-1BB分子能够提供第二个激活信号并进一步加强TCR/CD3信号。然而，不管何种CAR-T细胞，其只能对改造后的T细胞提供刺激信号，缺乏旁观者功能，并不能激活周围T细胞，产生更强的群集效应，引起一系列激活T细胞功能的级联反应。
技术实现思路
本专利技术人经过深入的研究和创造性的劳动，设计了一种双向共刺激分子激活受体(DualCostimulatoryActivatedReceptor，DCR)，其通过共刺激信号分子胞外激活型抗体传递T细胞活化相关的第二信号。经修饰后的T细胞，不仅能通过胞外的CD137激活型抗体，激活自身的共刺激分子信号，还能通过与周围未修饰活化的T细胞接触后，激活被接触的T细胞的胞内的共刺激分子信号，促进T细胞活化、增殖与存活。特别是，当其与包含第一信号的第一代CAR-T共同修饰T细胞时，可以产生强烈的集群效应，杀伤肿瘤细胞。另外，这种双向激活的作用仅仅局限在相互接触的T细胞之间，不会像注射CD137的激活型抗体一样，引发强烈T细胞免疫，造成潜在严重毒副作用。由此提供了下述专利技术：本专利技术的一个方面涉及一种分离的多肽，其从N端到C端依次包括下述元件：可选的信号肽、激活共刺激信号分子的多肽(例如共刺激信号分子的激活型单链抗体或共刺激信号分子的配体)、胞外铰链区、跨膜区和胞内共刺激信号分子。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的多肽，其特征在于如下的(1)－(5)项中的任意1项、2项、3项、4项或者5项：(1)所述信号肽为膜蛋白信号肽；优选地，所述信号肽为选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽中的一种或多种；优选地，所述信号肽是CD8信号肽；优选地，CD8信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；(2)所述共刺激信号分子的激活型单链抗体选自CD137激活型单链抗体、CD28激活型单链抗体和CD40激活型单链抗体中的任意一种或者多种；所述共刺激信号分子的配体选自CD137的配体、CD28的配体和CD40的配体中的任意一种或多种；优选地，所述CD137激活型单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；优选地，所述CD28激活型单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:31所示；优选地，所述CD40激活型单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:55所示；优选地，所述CD137的配体是4-1BBL；优选地，所述CD28的配体是CD80/CD86；优选地，所述CD40的配体是CD40L；(3)所述胞外铰链区为选自IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28铰链区和CD8铰链区的一种或多种；优选地，为CD8铰链区；优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；优选地，为IgG4FcCH2CH3铰链区；优选地，所述IgG4FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:56所示；(4)所述跨膜区为选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；优选地，所述跨膜区为CD28跨膜区；优选地，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；(5)所述胞内共刺激信号分子选自CD28胞内结构域、CD134/OX40胞内结构域、CD137/4-1BB胞内结构域、LCK胞内结构域、ICOS胞内结构域和DAP10胞内结构域中的一种或多种；优选地，所述胞内共刺激信号分子为CD28胞内结构域和/或CD137胞内结构域；优选地，所述CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；优选地，所述CD137胞内结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的多肽，其从N端到C端依次包括下述元件：可选的CD8信号肽、CD137激活型单链抗体、CD8胞外铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和/或CD137胞内结构域；可选的CD8信号肽、CD28激活型单链抗体、CD8胞外铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和/或CD137胞内结构域；或者可选的CD8信号肽、CD40激活型单链抗体、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和/或CD137胞内结构域。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的多肽，其如图1A-1至图1D-1所示。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的多肽，其如图1A-2至图1D-2所示。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的多肽，其如图1A-3至图1D-3所示。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:7至SEQIDNO:14中任一序列所示；SEQIDNO:32至SEQIDNO:39中任一序列所示；或者SEQIDNO:57至SEQIDNO:64中任一序列所示。本专利技术的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本专利技术中任一项所述的分离的多肽；优选地，所述分离的多核苷酸的序列如SEQIDNO:15或SEQIDNO:22中任一序列所示；SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的多肽，其从N端到C端依次包括下述元件：可选的信号肽、激活共刺激信号分子的多肽(例如共刺激信号分子的激活型单链抗体或共刺激信号分子的配体)、胞外铰链区、跨膜区和胞内共刺激信号分子。

【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其从N端到C端依次包括下述元件：可选的信号肽、激活共刺激信号分子的多肽(例如共刺激信号分子的激活型单链抗体或共刺激信号分子的配体)、胞外铰链区、跨膜区和胞内共刺激信号分子。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于如下的(1)－(5)项中的任意1项、2项、3项、4项或者5项：(1)所述信号肽为膜蛋白信号肽；优选地，所述信号肽为选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽中的一种或多种；优选地，所述信号肽是CD8信号肽；优选地，CD8信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；(2)所述共刺激信号分子的激活型单链抗体选自CD137激活型单链抗体、CD28激活型单链抗体和CD40激活型单链抗体中的任意一种或者多种；所述共刺激信号分子的配体选自CD137的配体、CD28的配体和CD40的配体中的任意一种或多种；优选地，所述CD137激活型单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；优选地，所述CD28激活型单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:31所示；优选地，所述CD40激活型单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:55所示；优选地，所述CD137的配体是4-1BBL；优选地，所述CD28的配体是CD80/CD86；优选地，所述CD40的配体是CD40L；(3)所述胞外铰链区为选自IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28铰链区和CD8铰链区的一种或多种；优选地，为CD8铰链区；优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；优选地，为IgG4FcCH2CH3铰链区；优选地，所述IgG4FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:56所示；(4)所述跨膜区为选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；优选地，所述跨膜区为CD28跨膜区；优选地，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；(5)所述胞内共刺激信号分子选自CD28胞内结构域、CD134/OX40胞内结构域、CD137/4-1BB胞内结构域、LCK胞内结构域、ICOS胞内结构域和DAP10胞内结构域中的一种或多种；优选地，所述胞内共刺激信号分子为CD28胞内结构域和/或CD137胞内结构域；优选地，所述CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；优选地，所述CD137胞内结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其从N端到C端依次包括下述元件：可选的CD8信号肽、CD137激活型单链抗体、CD8胞外铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和/或CD137胞内结构域；可选的CD8信号肽、CD28激活型单链抗体、CD8胞外铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和/或CD137胞内结构域；或者可选的CD8信号肽、CD40激活型单链抗体、IgG4FcCH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和/或CD137胞内结构域。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:7至SEQIDNO:14中任一序列所示；SEQIDNO:32至SEQIDNO:39中任一序列所示；或者SEQIDNO:57至SEQIDNO:64中任一序列所示。5.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至4中任一权利要求所述的分离的多肽；优选地，所述分离的多核苷酸的序列如SEQIDNO:15或SEQIDNO:22中任一序列所示；SEQIDNO:40至SEQIDNO:47中任一序列所示；或者SEQIDNO:65至SEQIDNO:72中任一序列所示。6.一种核酸构建体，包含权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，金华君，许慧敏，刘祥箴，李林芳，王超，
申请(专利权)人：上海细胞治疗研究院，上海细胞治疗集团有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31