杂交瘤细胞株AntiTput-13及其分泌的AntiTput-DP10单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及尘螨变应原相关的基因工程领域，公开了一株杂交瘤细胞株AntiTput‑13，能稳定的分泌抗腐食酪螨变应原Der p10的单克隆抗体，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.16298,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路号院号，中国科学院微生物研究所。试验证明该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体antiTPUT‑DP10与腐食酪螨变应原Der p10能够发生特异性反应。以该杂交瘤分泌单克隆抗体为基础，建立了检测腐食酪螨的双夹心ELISA方法，为屋舍、仓储、田间等环境精准检测腐食酪螨等粉尘螨的诊断方法奠定基础。

Hybridoma cell line AntiTput-13 and its secreted AntiTput-DP10 monoclonal antibody

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株AntiTput-13及其分泌的AntiTput-DP10单克隆抗体
本专利技术属于尘螨变应原相关的基因工程领域，具体涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的抗腐食酪螨变应原Derp10蛋白的单克隆抗体。
技术介绍
腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)属于蛛形纲(Arachinida)、蜱螨亚纲(Acari)，真螨目(Acariformes)粉螨亚目(Acaridida)，是世界性分布的仓储害螨，寄主范围广，也广泛存在于人类生活和工作环境中。其螨体及代谢物、排泄物等均具有较强变应原性，可引起过敏性哮喘、皮炎、过敏性鼻炎等Ⅰ型变态反应性疾病，是粉尘螨、屋尘螨的成员之一。研究表明约50％以上的Ⅰ型超敏反应性疾病患者由尘螨引起，全球人口总数的10～20％对尘螨过敏。1964年Voorhort等发现螨是屋尘中主要的变应原以来，人们已发现尘螨变应原约有20种，粉尘螨和屋尘螨存在高度的交叉反应性，绝大多数尘螨患者都是屋尘螨和粉尘螨共同致敏。其中，屋尘螨的第一组分变应原Derp1主要存在于屋尘螨排泄物中，第2组分变应原Derp2主要存在于螨体内，Derp1和Derp2是80％以上屋尘螨过敏患者的主要致敏组分。粉尘螨第1组变应原组分Derf1和第2组变应原组分Derf2是主要的致敏组分。Derf1和Derp1可以诱导交叉反应，而Derf2和Derp2几乎完全交叉。屋尘螨第10类变应原Derp10虽不是主要致敏组分，而是交叉反应的主要致敏蛋白，提示Derp10可作为屋尘螨与其他变应原存在交叉反应的监测致敏组分。研究还显示，Derp10是一种导致全身性严重变态反应的重要变应原。Derp10和Derf10相比，在全序列中只有3个氨基酸不同，序列一致性达98.5％，广泛存在于尘螨肌肉和非肌肉细胞中，它们存在交叉反应的结论已确定。Derp10蛋白质结构与无脊椎动物中的原肌球蛋白非常相似，如虾，龙虾，螃蟹，蟑螂和其他软体动物。Derp10因其广泛的交叉反应性特点，除在螨虫过敏患者中呈阳性，且在蟑螂、虾蟹类和贝类食物的交叉过敏中也发挥重要作用。在交叉反应的抑制试验中，尘螨浸液是强烈的抑制因子，表明在致敏的变应原中尘螨是主要的来源。因此，Derp10受到广泛关注，但作为尘螨的原肌球蛋白Derp10还没有详细的报道。抗体是生物及医学领域用途极为广泛的蛋白质分子。单克隆抗体是由于免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的淋巴细胞杂交瘤产生的，该杂交瘤不仅具有瘤细胞不断分裂的能力，而且具有免疫细胞产生抗体的能力。由于单克隆抗体是特异性抗体，特异性强，因此得到广泛应用。变应原单克隆抗体可以制成试纸条或ELISA试剂盒等用于进行环境中尘螨变应原的检测或根据检测环境中变应原的量推测螨虫种群的数量。所以，筛选出一株可以分泌抗Derp10蛋白的特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的Derp10蛋白特异性B细胞表位多肽对Derp10变应原的诊断及预防具有积极意义，并为Derp10诊断试剂盒的研制奠定基础。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一株分泌Derp10变应原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本专利技术目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体antiTPUT-DP10，该单克隆抗体antiTPUT-DP10可与Derp10蛋白发生特异性反应；其序列为:MNHKVHHHHHHMEAIKKKMQAMKLEKDNAIDRAEIAEQKARDANLKSEKTEEEVRALQKKIQQIENELDQVQENLTQATTKLEEKEKALQTAEADVAALNRRIQLIEEDLERSEERLKVATAKLEEASHSADESERMRKMLEHRSITDEERMDGLESQLKEARLMAEDADRKYDEVARKLAMVEADLERAEERAETGESKIVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEKAQQREEAYEQQIRIMTSKLKEAEARAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVHEKEKYESISDELDQTFAELTGY本专利技术上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术采用TRIZOL法提取腐食酪螨总RNA，反转录克隆原肌球蛋白基因(Derp10)的cDNA，将该cDNA插入原核表达载体pCzn1，利用pCzn1原核表达载体对Derp10基因进行原核表达，将所表达出的包涵体形式的Derp10经HIS标签亲和纯化后作为免疫原，免疫SPFBALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。此外，本专利技术还利用大肠杆菌表达系统对Derp10基因进行原核表达，对所表达的包涵体形式的Derp10蛋白进行包涵体纯化后作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终获得一株稳定分泌抗Derp10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC16298，其命名为AntiTput-13，分类命名是：分泌抗Derp10变应原单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏时间：2018年9月13日；保藏单位是：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。本专利技术还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其命名为AntiTput-DP10，Western-blot检测结果表明单克隆抗体AntiTput-DP10可与Derp10蛋白发生特异性反应，ELISA检测结果表明单克隆抗体AntiTput-DP10与Derp10发生特异性反应。在本专利技术的一种实施方式中,以的腐食酪螨多抗为包被抗体,抗体标记后单克隆抗体AntiTput-DP10为酶标抗体,建立检测腐食酪螨的双抗体夹心工法,用此建立的双抗夹心法检测检测屋舍、仓储、田间等环境中腐食酪螨，具有实际应用价值。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1重组pCzn1-TM-T质粒酶切结果，其中M：DNAMarker；1：酶切前质粒；2：酶切后质粒；图2是重组pCzn1-TM-T蛋白的SDS-PAGE分析结果，其中M：标准蛋白Marker；1：pCzn1-TM-T诱导前产物；2：pCzn1-TM-T诱导后产物；3：pCzn1-TM-T纯化产物。图3是为单克隆抗体AntiTput-DP10纯化后SDS-PAGE分析，其中1：标准蛋白Marker；2：单克隆抗体antiTPUT-DP10重链与轻链。图4是为应用Westernblot试验检测单克隆抗体antiTPUT-DP10与Derp10蛋白WB分析，其中1：螨虫裂解沉淀后产物；M：标准蛋白Marker。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。主要实验材料和来源1、细胞、尘螨和血清SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，HGPRT缺失；不生成免疫球蛋白且通过支原体检测,均由本实验室保存，腐食酪螨在本实验室种群饲养。腐食酪螨阳性、阴性血清由实验室制备，经ELISA实验检测为阴性和阳性。2、主要试剂和药品胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株杂交瘤细胞株AntiTput‑13，能稳定的分泌抗腐食酪螨变应原Der p10的单克隆抗体，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.16298,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路号院号，中国科学院微生物研究所。

【技术特征摘要】
1.一株杂交瘤细胞株AntiTput-13，能稳定的分泌抗腐食酪螨变应原Derp10的单克隆抗体，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.16298,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路号院号，中国科学院微生物研究所。2.一种抗腐食酪螨变应原Derp1...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲绍轩，李辉平，马林，骆昕，蒋宁，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32