一种HMGB1封闭性抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种HMGB1封闭性抗体的制备方法，其包括：将免疫原在大肠杆菌中过表达，并采用Ni‑亲和色谱法进行纯化；采用免疫原免疫BALB/C小鼠，选取具有最佳免疫应答的小鼠进行融合；将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂种细胞，并培养克隆，选择稳定的克隆；将杂种细胞注射到小鼠的腹膜腔中，收集10‑14天后的腹水，进行抗体筛选和测试，采用蛋白A/G亲和层析或抗原亲和层析以纯化腹水液，获得HMGB1封闭性抗体，并对抗体的封闭性效果进行验证。本发明专利技术还涉及上述制备方法制得的HMGB1封闭性抗体及其应用。本发明专利技术通过中和性抗体封闭HMGB1的作用，能够有效缓解由非酒精性脂肪肝导致的肝脏炎症，为将来临床应用HMGB1中和性抗体治疗非酒精性脂肪肝提供理论和实验证据。

Preparation and application of a blocking antibody against HMGB1

【技术实现步骤摘要】
一种HMGB1封闭性抗体的制备方法及其应用
本专利技术属于抗体制备
，尤其是涉及一种HMGB1封闭性抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
随着全球流行病的迅速增长，非酒精性脂肪肝病(NonalcoholicFattyLiverDisease，NAFLD)是引起肝功能异常的最常见原因之一。相关证据表明NAFLD和肝癌之间存在重大关联，NAFLD和肝癌都被认为是代谢综合征的一部分。肝癌(HCC)是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，并且是中国人与癌症相关的死亡的第二大诱因，而且HCC的发病率预计在未来10-20年期间会增加。大多数患有NAFLD的患者没有任何症状，且其中20-25％逐渐发展为更严重的慢性炎症性肝病，定义为非酒精性脂肪性肝炎(NonalcoholicSteatohepatitis，NASH)，其与肝纤维化、肝硬化及最终的HCC有关。TLR4是一种模式识别受体，其在保守病原体相关分子模式(PAMPs)和内源性损伤相关分子模式(DAMPs)的检测中扮演重要的角色。DAMPs包括高迁移率族蛋白1(HMGB1)，这是一个广泛表达的非组蛋白核蛋白。据报道TLR4通过调节炎症反应和组织修复维持组织稳态，因此，在NAFLD中发挥关键作用。之前的研究报道了肝实质细胞的TLR4/MyD88在早期高脂肪饮食诱导的NAFLD中具有关键作用，其中，肝细胞释放的HMGB1作为配体介导了NAFLD早期TLR4的激活。另外，HMGB1和TLR4参与了由JNK1介导的线粒体损伤，以及由此导致的肝细胞游离胆固醇脂毒性。这些研究提供了靶向HMGB1的可能性，并将会为NAFLD的治疗提供新的机会。但是，目前的研究仍存在亟待解决的某些问题，例如除了HMGB1是否还有其他的DAMPs参与NAFLD的炎症和肝脏损伤，-导致HMGB1的上调和释放的上游信号仍然不清楚，以及HMGB1封闭在动物水平是否能有效缓解NAFLD等。
技术实现思路
为了于克服现有技术和研究中的缺陷，本专利技术通过TLR4内源性配体表达谱检测、HMGB1作用研究以及HMGB1封闭性抗体的应用，来研究核因子HMGB1在非酒精性脂肪肝发生发展中的作用及机制，以为克服非酒精性脂肪肝这一影响人类健康的重大难题提供新的策略。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种HMGB1封闭性抗体的制备方法，其包括如下步骤：步骤a、选取SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列中的至少一种作为免疫原，将所述免疫原在大肠杆菌中过表达，并采用Ni-亲和色谱法进行纯化；步骤b、将步骤a中纯化后的免疫原免疫BALB/C小鼠，选取具有最佳免疫应答的小鼠，进行融合；步骤c、将步骤b中的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂种细胞，并稀释该杂种细胞混合物，在培养基中培养克隆，选择稳定的克隆；步骤d、将杂种细胞注射到小鼠的腹膜腔中，收集10-14天后的腹水，采用蛋白A/G亲和层析或抗原亲和层析以纯化腹水液，获得HMGB1封闭性抗体。为了进一步优化上述HMGB1封闭性抗体的制备方法，本专利技术采取的技术措施还包括：进一步地，所述SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列分别为R583-1-1-1蛋白的1-215aa和R583-1-1-2蛋白的8-215aa，其具体氨基酸序列如下所示：R583-1-1-1蛋白1-215aa：MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEDDEEDEEDEEEEEEEEDEDEEEDDDDE(SEQIDNO.1)；R583-1-1-2蛋白8-215aa：KPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEDDEEDEEDEEEEEEEEDEDEEEDDDDE(SEQIDNO.2)。进一步地，采用R583-1-1-1蛋白的1-215aa和R583-1-1-2蛋白的8-215aa作为免疫原，用R583-1-1-1和R583-1-1-2的混合免疫原免疫BALB/C小鼠。进一步地，所述步骤b中采用的BALB/C小鼠为8至12周龄的BALB/C雌性小鼠。进一步地，所述步骤c中培养克隆的方式为在HAT培养基中的微量滴定孔上由单亲细胞培养克隆。进一步地，在所述步骤d之后，验证所述HMGB1封闭性抗体的封闭性效果。进一步地，所述HMGB1封闭性抗体为小鼠抗HMGB1单克隆抗体。本专利技术的第二个目的是一种由任一上述的制备方法制得的HMGB1封闭性抗体。本专利技术的第三个目的是提供一种如上所述的HMGB1封闭性抗体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种如上所述的HMGB1封闭性抗体在制备缓解由非酒精性脂肪肝导致的肝脏炎症的药物中的应用。进一步地，所述药物为注射剂型药物，其可以添加医药用途中可接受的辅剂。与现有技术相比，本专利技术采用上述技术方案具有以下有益效果：本专利技术通过研究发现在非酒精性脂肪肝病早期阶段，肝细胞内的TLR4内源性配体HMGB1表达升高并且分泌出去，促进了肝脏的炎症反应，通过中和性抗体封闭HMGB1的作用，能够有效缓解由非酒精性脂肪肝导致的肝脏炎症，并显著改善肝功能，为将来临床应用HMGB1中和性抗体治疗非酒精性脂肪肝提供理论和实验证据。附图说明图1是本专利技术一实施例中NAFLD不同阶段的TLR4内源性配体表达谱；图2是本专利技术一实施例中采用免疫原进行第3次免疫后小鼠血清的ELISA结果图；图3是本专利技术一实施例中验证HMGB1封闭性抗体的敏感性的结果图；图4是本专利技术一实施例中验证HMGB1封闭性抗体的特异性的结果图；图5是本专利技术一实施例中在处理的不同时间点观察封闭HMGB1对于NAFLD的影响结果图；其中A部分表示受HMGB1活化的TLR4信号转导通路活性的影响；B部分表示HMGB1封闭性抗体对HFD引起的肝脏炎症基因的表达的影响；C部分表示HMGB1封闭性抗体对HFD引起的肝脏炎症细胞的浸润的影响；图6是本专利技术一实施例中封闭HMGB1对老鼠肝脏中脂肪储积的影响；图7是本专利技术一实施例中封闭HMGB1对老鼠肝脏中脂肪代谢相关基因的表达的影响；图8是本专利技术一实施例中封闭HMGB1对老鼠肝功能损伤的影响。具体实施方式本专利技术涉及一种HMGB1封闭性抗体的制备方法，其包括如下步骤：设计免疫原，并将免疫原在大肠杆菌中过表达，并采用Ni-亲和色谱法进行纯化；采用免疫原免疫BALB/C小鼠，选取具有最佳免疫应答的小鼠，进行融合；将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂种细胞，并稀释该杂种细胞混合物，在培养基中培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HMGB1封闭性抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a、选取SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列中的至少一种作为免疫原，将所述免疫原在大肠杆菌中过表达，并采用Ni‑亲和色谱法进行纯化；步骤b、将步骤a中纯化后的免疫原免疫BALB/C小鼠，选取具有最佳免疫应答的小鼠，进行融合；步骤c、将步骤b中的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂种细胞，并稀释该杂种细胞混合物，在培养基中培养克隆，选择稳定的克隆；步骤d、将杂种细胞注射到小鼠的腹膜腔中，收集10‑14天后的腹水，采用蛋白A/G亲和层析或抗原亲和层析以纯化腹水液，获得HMGB1封闭性抗体。

【技术特征摘要】
1.一种HMGB1封闭性抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a、选取SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列中的至少一种作为免疫原，将所述免疫原在大肠杆菌中过表达，并采用Ni-亲和色谱法进行纯化；步骤b、将步骤a中纯化后的免疫原免疫BALB/C小鼠，选取具有最佳免疫应答的小鼠，进行融合；步骤c、将步骤b中的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂种细胞，并稀释该杂种细胞混合物，在培养基中培养克隆，选择稳定的克隆；步骤d、将杂种细胞注射到小鼠的腹膜腔中，收集10-14天后的腹水，采用蛋白A/G亲和层析或抗原亲和层析以纯化腹水液，获得HMGB1封闭性抗体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中的采用的免疫原为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列，在步骤b中采用免疫原混合物免疫BALB/C小鼠。3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红阳，李亮，陈磊，陈昕，凌妍，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学国家肝癌科学中心，
类型：发明
国别省市：上海,31